血管性痴呆（VaD）约占所有痴呆患者的17-20%,是继阿尔茨海默氏病（AD）之后的第二大痴呆形式,在老年人群中流行。VaD可由供血减少引起,这可能与中风有关,也可能与中风无关。VaD的诊断不足、缺乏治疗选择、预期寿命的增加以及罹患高血压、心脏病、糖尿病、代谢综合征和中风等危险因素人口的稳步增长,都要求开发VaD的治疗方法。目前尚没有FDA批准的VaD治疗方案,一些研究旨在开发一个良好的VaD动物模型,作为探索治疗方案的第一步。本研究应用目前公认的最有前景的双侧颈总动脉缩窄模型（BCAS）作为研究VaD的动物模型。垂体腺苷酸环化酶激活多肽（PACAP）是一种最初从羊脑下丘脑中分离出来的神经肽。PACAP已被证明影响神经传递、神经保护、血管舒张、神经调节和免疫抑制等多种生理活动。一些研究也表明PACAP能有效保护神经元免受缺血性神经损伤。PACAP及其受体也被证明参与学习和记忆过程。然而,关于PACAP促进突触可塑性、提高认知能力的研究较少,特别是PACAP诱导的神经保护对慢性低灌注（CCH）引起的认知损害的可能作用尚不清楚。本研究通过构建VaD动物模型以及氧-葡萄糖剥夺（OGD）神经元细胞模型,通过对模型脑组织的病理变化、行为学改变、认知相关蛋白的研究,以及应用神经元细胞系对PACAP作用的相关通路的基础研究,在体内、体外证实了PACAP的神经保护作用。首次阐明了PACAP-Sirt3-BDNF通路对突触完整性的重要作用。PACAP可抑制神经元细胞凋亡,通过Sirt3增强突触可塑性来保护CCH所致的认知功能障碍。第一部分PACAP,Sirt3以及突触蛋白在VaD模型中表达量显著降低目的:建立VaD的小鼠模型,检测在该模型中PACAP,Sirt3,BDNF,PSD-95等蛋白的表达量变化,以明确PACAP,Sirt3,突触蛋白等关键性蛋白在此模型中的作用。方法:1.选择实验动物:从北京维通利华实验动物公司购买SPF级雄性C57BL/6小鼠,体重23到26g,9到11周龄。小鼠饲养环境:保持室内温度在24±2℃、相对湿度维持在50%-60%恒定,并人工给予明-暗12小时交替循环的照明,给小鼠提供足够的饲料和干净的饮用水。2.建立双侧颈总动脉狭窄BCAS模型:通过BCAS手术建立VaD模型:模型采用水合氯醛（5%,350mg/kg）腹腔麻醉小鼠。用尖镊钝性分离颈动脉鞘,在颈总动脉内侧分离血管（其外侧有白色粗大迷走神经,误伤后小鼠呼吸迅速停止）。在颈总动脉分叉处（颈内动脉和颈外动脉分叉）处下缘挂线,提起颈总动脉,将0.18mm的弹簧圈迅速缠绕旋转到血管上,确保血管走形顺畅,无迂曲。间隔30分钟,同样的方法,将弹簧圈套至对侧颈总动脉处.随后迅速缝合皮肤及筋膜,置于保温箱内至完全苏醒后常规饲养。假手术组除不套弹簧圈外其余步骤同上。BCAS术后30天进行认知行为测试,完成模型构建。3.应用激光散斑检测VaD小鼠模型的脑血流变化:将麻醉后的小鼠沿中线切开颅骨皮肤,充分暴露颅骨,呈俯卧位,用激光散斑检测小鼠脑血流,连续监测3-5分钟,待数值稳定后记录血流数值。记录激光散斑血流图像,用于识别感兴趣区域（ROI）。在这些ROI中,实时计算平均血流指数。分别于手术前及手术后30分钟检测小鼠脑血流的变化情况。4.通过新事物识别实验检测VaD小鼠模型的认知水平:在灯光昏暗的房间里,将小鼠置于正方形的开阔场地（边长40 cm,高40 cm）中进行实验。实验前,小鼠在无物体的空旷环境中熟悉2天,每天自由活动10分钟熟悉实验环境。在第三天的测试中,小鼠暴露在两个相同的事物（物体A和B）环境中,在正方形场地自由探索10分钟（训练阶段）,然后放回至鼠笼。24小时后进行测试前,将两个相同物体中的一个随机更换。老鼠被放回开阔的场地自由探索5分钟。更换物品的颜色、形状和大小与训练阶段的物体完全不同。为了避免嗅觉提示,在两次实验之间应用75%酒精擦拭清洁场地和物体。小鼠物体偏好的测量公式为:探索新对象的时间×100/探索新事物加熟悉事物的时间。用Eth Vision XT软件跟踪记录动物轨迹。5.应用尼氏染色检测VaD小鼠模型的大脑皮层细胞凋亡情况:BCAS术后30天,取小鼠脑组织固定后,石蜡包埋,冠状切成6μm厚蜡片置于载玻片上。脱蜡和梯度酒精水化后,大脑切片浸没在甲苯胺蓝染料溶液中,放入56°C烤箱孵育25分钟。大脑切片用双蒸水洗5分钟。随后置于75%,95%和100%乙醇中梯度脱水各3秒钟进行脱色。脱色后切片置于二甲苯中5分钟,2次。最后,用中性树胶密封切片。使用Eclipse CI-L显微镜选择组织靶区（皮质）进行400倍成像。使用Image-Pro Plus 6.0分析软件测量每个视场的神经元数量,记为A,对应的组织面积（mm2）记为B,神经元密度计算为n/mm2（A/B）。6.应用透射电镜观察VaD小鼠模型的神经元及线粒体形态变化:为观察大脑皮层神经元的超微结构,取1 mm3体积的皮层脑组织,用2%多聚甲醛和2.5%戊二醛混合物固定2小时,组织脱水后包埋于Epon树脂中。切取70 nm厚度的超薄切片,用柠檬酸铅和醋酸铀染色,在透射电子显微镜下观察神经元及其线粒体的形态变化。7.应用Western blot方法检测相关蛋白的表达量:包括总蛋白提取、测定蛋白浓度、电泳、转膜、封闭、抗体孵育、扫膜、分析等步骤。8.应用免疫荧光染色观察突触蛋白PSD-95表达变化:石蜡切片脱蜡后,用梯度酒精水化组织切片,用柠檬酸钠溶液在92-96℃微波浸泡修复抗原30分钟。脑组织用10%的山羊血清室温孵育1小时。去除多余血清后,加入兔抗PSD-95一抗,4℃过夜。隔天用PBS清洗组织切片3次,每次5分钟。用Alexa FluorTM 488驴抗兔抗体室温下避光孵育1小时。PBS洗3次,5分钟。用含DAPI的防淬灭封片剂密封组织,4°C避光保存,然后用荧光显微镜拍照拍摄。图片采用Image J软件进行半定量分析。9.统计学方法:结果以均数±标准差（mean±SEM）表示。正态性检验采用Shapiro-Wilk检验。组间差异采用非配对学生t检验。多组间差异采用One-way ANOVA。非参数数据采用Mann-Whitney U检验。使用SPSS 23.0进行数据统计分析。当P值小于0.05时被认为有统计学意义。所有实验至少重复3次。结果:1.BCAS造模后,小鼠脑血流明显下降:BCAS小鼠脑血流下降34.5%（术前vs.术后30min,P<0.001）。2.术后30天,BCAS组小鼠出现认知障碍:BCAS组小鼠探索新事物的时间比假手术组下降24.80%（P<0.01）。3.VaD小鼠脑组织尼氏染色未见明显的神经元凋亡。4.VaD小鼠神经元超微结构发生变化:通过透射电子显微镜观察到神经元细胞异形,细胞核固缩,线粒体肿胀,嵴数量减少。5.VaD小鼠脑组织中PACAP,Sirt3蛋白表达量降低,突触可塑性下降:根据Western Blot结果发现,VaD组脑组织中PACAP蛋白水平下降（58.84%decrease vs.Sham,P<0.01）,PAC1蛋白水平下降不明显。此外,Sirt3、BDNF和PSD-95蛋白水平在VaD组均降低,而SYN未见明显降低。免疫荧光染色显示,与假手术组相比,VaD组突触蛋白PSD-95降低,提示突触功能和可塑性降低。小结:BCAS造模30天出现认知障碍,成功构建VaD小鼠模型,该模型中脑组织超微结构发生变化,并且PACAP,Sirt3及突触蛋白表达量明显降低。第二部分PACAP通过作用于Sirt3提高突触可塑性并发挥抗凋亡作用目的:建立细胞氧-葡萄糖剥夺OGD模型模拟脑组织低灌注条件,观察Sirt3,凋亡相关蛋白及突触蛋白干预后的表达变化,外源性应用PACAP1-38预处理神经元细胞,明确其在OGD中的保护作用。应用Lenti-virus在神经元细胞内过表达以及敲低Sirt3,探索突触蛋白的表达变化,阐明PACAP在神经元细胞发挥保护作用的机制。方法:1.细胞培养以及建立OGD模型:应用DMEM培养基培养HT22海马神经元细胞系。OGD模型:取生长至80-90%的细胞,用OGD缓冲液冲洗3次;去除OGD缓冲液,重新加入OGD缓冲液;将培养板置于低氧工作站,向工作站内通入5%CO2、94%N2、1%O2的混合气体后保持37℃恒温培养。2.构建慢病毒稳转细胞系:为过表达Sirt3,将外源小鼠Sirt3 cDNA序列亚克隆到Lenti-CMV-GFP载体中。另外,构建19个核苷酸的短序列,将Sirt3位点764靶向转染到Omics Link小发夹RNA（sh RNA）表达克隆中以敲低Sirt3的表达。病毒颗粒侵染细胞:用慢病毒侵染细胞,并应用嘌呤霉素进行筛选。成功转染的细胞表达绿色荧光。3.应用PACAP1-38干预HT22细胞:将PACAP1-38用无菌水配制成0.1 mg/ml的原液,用新鲜DMEM培养基稀释配制成不同的药物浓度,与HT22细胞共培养24小时。4.应用CCK-8试剂盒测定HT22细胞的细胞活力:HT22细胞被接种到96孔板（接种细胞悬液为100μl/孔,5000个细胞/孔）,经过OGD处理后向每孔加入10μl CCK溶液,后将培养板放入培养箱继续培养1小时,然后用酶标仪测定在450nm处的吸光度。5.应用Western blot方法检测相关蛋白的表达量:包括总蛋白提取、测定蛋白浓度、电泳、转膜、封闭、抗体孵育、扫膜、分析等步骤。6.应用细胞免疫荧光染色检测PSD-95表达量:接种于包被好的48孔板爬片上的细胞用PBS洗涤3次,除去残留培养基,然后用4%多聚甲醛固定10分钟。固定后用PBS洗涤细胞3次,5分钟。然后用10%的羊血清室温孵育1小时,去除多余血清后,加入兔抗PSD-95一抗,4℃过夜。隔天用PBS清洗细胞3次,每次5分钟。用Alexa FluorTM488驴抗兔抗体室温下避光孵育1小时。然后用PBS洗3次,每次5分钟。将爬片捞出,倒置于滴有20μl含DAPI防淬灭封片剂的玻片上,4℃避光保存,荧光显微镜下观察。图片采用Image J软件进行半定量分析。7.统计学方法结果以均数±标准差（mean±SEM）表示。正态性检验采用Shapiro-Wilk检验。组间差异采用非配对学生t检验。多组间差异采用One-way ANOVA。非参数数据采用Mann-Whitney U检验。使用SPSS 23.0进行数据统计分析。当P值小于0.05时被认为有统计学意义。所有实验至少重复3次。结果:1.PACAP1-38能够促进HT22细胞中PACAP,Sirt3,BDNF的蛋白表达:以50n M和100n M PACAP1-38培养细胞后,PACAP水平均明显升高（435.10%increase vs.0n M,P<0.05;1479.00%increase vs.0n M,P<0.05）。100n M PACAP1-38预处理细胞后Sirt3和BDNF表达均升高（42.41%increase vs.0n M,P<0.05;44.80%increase vs.0n M,P<0.05）。PSD-95蛋白无明显变化。2.在OGD条件下,PACAP能够提高HT22细胞的活力:HT22细胞经OGD处理2小时后,细胞活力开始下降,4小时下降至75.89%（p<0.001）,6小时下降至48.71%（P<0.001）。OGD 6小时观察到,200n M PACAP1-38预处理可使细胞活力提高39.57%（P<0.05）。3.PACAP可以增强氧糖剥夺条件下突触可塑性,抑制细胞凋亡:OGD处理6小时后,Sirt3,BDNF,PSD-95蛋白水平均下降,经过PACAP1-38预处理24小时组的细胞中Sirt3,BDNF,PSD-95蛋白表达水平较不用PACAP组升高。抗凋亡蛋白Bcl-2以及Bcl-2/Bax经OGD 6小时处理后下降,PACAP1-38预处理后恢复。4.Sirt3可以调节BDNF和突触可塑性:通过慢病毒转染,敲低或者过表达Sirt3,发现BDNF和PSD-95蛋白水平随着Sirt3的表达变化发生一致性变化,即敲低Sirt3后,BDNF和PSD-95表达量下降,PACAP1-38并不能改善敲低Sirt3带来的影响。过表达Sirt3后,BDNF和PSD-95表达水平升高。小结:PACAP1-38能够促进HT22细胞中PACAP,Sirt3,BDNF的蛋白表达,并且可以提高HT22细胞在氧糖剥夺条件下的细胞活力,同时增强其突触可塑性,抑制氧糖剥夺导致的细胞凋亡。第三部分PACAP通过提高突触可塑性有效改善VaD认知障碍目的:建立VaD的小鼠模型,用PACAP1-38干预模型小鼠,观察是否可以提高突触可塑性相关蛋白的表达水平并且改善VaD的认知障碍。方法:1.选取实验动物:从北京维通利华实验动物公司购买SPF级雄性C57BL/6小鼠,体重23到26g,周龄9到11周。将小鼠饲养于室内温度在24±2℃、相对湿度在50%-60%的恒温恒湿的环境中,并人工给予明-暗12小时交替循环的照明,给小鼠提供足够的饲料和干净的饮用水。2.建立VaD模型及分组:将双侧颈总动脉缩窄（BCAS）30天后的VaD模型小鼠分为两组:BCAS+NS组（生理盐水治疗3μl/鼻孔）,和BCAS+PACAP组（PACAP1-38以0.1μg/μl浓度治疗,3μl/鼻孔）。每天固定同一时间给药,5次/周,持续4周。3.通过新事物识别实验检测VaD小鼠模型的认知水平:实验前,小鼠在无物体的空旷环境中熟悉2天,每次自由活动10分钟熟悉实验环境。在第三天的测试中,小鼠暴露在两个相同的事物（物体A和B）环境中,在正方形场地自由探索10分钟（训练阶段）,然后放回至鼠笼。24小时后进行测试前,将两个相同物体中的一个随机更换。老鼠被放回开阔的场地自由探索5分钟。更换物品的颜色、形状和大小与训练阶段的物体完全不同。两次试验之间应用75%酒精擦拭清洁场地和物体。小鼠物体偏好的测量公式为:探索新对象的时间×100/探索新事物和熟悉事物的时间。用Eth Vision XT软件跟踪记录动物轨迹。4.应用Western blot方法检测相关蛋白的表达量:包括总蛋白提取、测定蛋白浓度、电泳、转膜、封闭、抗体孵育、扫膜、分析等步骤。5.所有数据以均数±标准差（mean±SEM）表示。正态性检验采用Shapiro-Wilk检验。组间差异采用非配对学生t检验。多组间差异采用One-way ANOVA。非参数数据采用Mann-Whitney U检验。使用SPSS 23.0进行数据统计分析。当P值小于0.05时被认为有统计学意义。所有实验至少重复3次。结果:1.PACAP1-38可以改善VaD小鼠PACAP、Sirt3、BDNF表达水平以及突触可塑性:与VaD+NS组相比,VaD+PACAP组的PACAP、PAC1、Sirt3、BDNF和PSD-95蛋白水平均升高。2.PACAP1-38可以改善VaD小鼠的认知障碍:BCAS+NS组小鼠探索新事物的时间比BCAS+PACAP组下降24.80%（P<0.01）。小结:经鼻给药PACAP1-38能够提高VaD小鼠脑组织中PACAP、Sirt3、BDNF表达水平以及突触可塑性,并且可以改善VaD小鼠的认知障碍。结论:1.VaD小鼠脑组织中PACAP,Sirt3,BDNF,PSD-95等认知相关蛋白表达下降。这提示其具有成为诊断标志物的潜力。2.PACAP能够提高氧糖剥夺后的神经元细胞活力,抑制其凋亡,改善PACAP,Sirt3,BDNF,PSD-95等认知相关蛋白水平。3.PACAP通过Sirt3调节神经元突触蛋白水平,改善神经元突触可塑性。4.PACAP通过调节PACAP-Sirt3-BDNF途径改善VaD小鼠的认知障碍。