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黄萎病是一种严重的植物维管束病害,引起植物萎蔫坏死,导致作物严重减产,在农业生产中造成了严重的经济损失。大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）作为黄萎病发生的主要致病菌,其寄主范围十分广泛,包括棉花、烟草、番茄等多种重要的经济作物,被称为棉花的“癌症”。大丽轮枝菌生理小种多、变异快、可以产生微菌核在土壤中存活长达十几年,对其防治十分困难。因此对大丽轮枝菌的致病机制研究为黄萎病的防治提供策略。植物病原菌在侵染宿主过程中,会和宿主产生多种多样的相互作用方式。植物会产生多种模式识别受体（pattern recognition receptors,PRRs）识别真菌中的病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）,从而引发PAMP触发的免疫（PAMP-triggered immunity,PTI）。同时植物病原菌会产生效应蛋白,定位于宿主细胞各个部位发挥作用,抑制宿主的PTI途径,从而促进病原菌的侵染和定殖。植物在长期的协同进化中产生抗性R蛋白,特异性识别效应蛋白,从而引发效应子触发的免疫（effector-triggered immunity,ETI）,引起更加强烈和持久的防御响应。课题组前期通过转录组分析,筛选到一个效应蛋白VdEf36,它在大丽轮枝菌侵染过程中表达量提高。我们对其功能进行了研究,得出以下结论:1)VdEf36是种属高度保守性的核定位蛋白VdEf36基因全长603 bp,不包含内含子,编码200个氨基酸。通过序列分析,我们发现VdEf36是个特异性极强的蛋白,在轮枝菌属高度保守,在其他物种中同源性较低,同源性相对最高的为地栖热硫杆菌NRRL蛋白,同源性为43.4%。VdEf36不含有已知功能的蛋白结构域,但信息学分析发现,VdEf36包含有一个长度为24aa的N-端信号肽和一个靠近C-端长度为11 aa的核定位信号（NLS）,序列为VRAKTKKQRLR。2)VdEf36基因的表达模式VdEf36基因的表达模式分析显示VdEf36在营养生长过程中表达量极低,而在大丽轮枝菌侵染棉花过程中特异性表达。VdEf36在大丽轮枝菌侵染棉花幼苗6 d时的表达量是其在CZA平板上生长6 d时的13倍。3)VdEf36定位在植物的细胞核中我们将VdEf36自身信号肽替换成植物分泌信号肽Mcsp,与荧光蛋白e GFP融合后构建在植物表达载体p LGN中。在本氏烟草中瞬时表达,通过荧光观察和DAPI共染,结果显示VdEf36定位在本氏烟草的细胞核中,因此效应蛋白VdEf36是大丽轮枝菌转运到植物细胞核中发挥作用的。我们进一步将VdEf36核定位信号中丙氨酸残基突变为谷氨酸残基后,VdEf36-nls无法定位在植物细胞核中,表明VdEf36核定位信号对其定位于植物细胞核中是必需的。4)VdEf36瞬时表达可以引起烟草的防御响应将VdEf36在烟草中瞬时表达可以引起强烈的ROS爆发,而对照组无法引起ROS爆发,通过ROS水平定量分析,Mcsp-VdEf36造成的ROS爆发水平是阴性对照组的2.9倍。将Mcsp-VdEf36和35S::e GFP在烟草中瞬时表达24 h后,在烟草叶片上接种灰霉菌,3 d后统计病斑发现,Mcsp-VdEf36瞬时表达可以造成灰霉菌病斑变小。VdEf36在烟草叶片瞬时表达后,通过RT-PCR测定发现烟草标志性防御基因被高水平诱导。Nt PR1基因的表达量提高了50倍,Nt PR4基因表达量提高了2.2倍,Nt NOA基因表达量提高了4.9倍。以上结果表明VdEf36在大丽轮枝菌侵染过程中被递送到植物细胞核中,并引起了植物的防御响应,而去掉信号肽后VdEf36无法引起植物的防御响应。5)VdEf36不参与大丽轮枝菌的营养生长、细胞壁合成和氧化还原相关反应我们对VdEf36进行了基因敲除,获得了敲除突变体ΔVdEf36。分析不同菌株在山梨醇、刚果红、H2O2、MND等胁迫条件的生长差异。结果发现,ΔVdEf36突变体与野生型V991相比,在生长形态上并无明显变化,说明VdEf36并不参与大丽轮枝菌的营养生长、细胞壁形成及氧化还原反应等生理生化过程。6)敲除VdEf36使大丽轮枝菌对棉花的致病力得到了提高为分析VdEf36敲除对菌株毒力的影响,将ΔVdEf36突变体及野生型V991菌株分别侵染棉花叶片和棉花幼苗。相较于野生型菌株,ΔVdEf36突变体在棉花叶片上造成更大的病斑,病斑面积较野生型造成的病斑面积提高了1.4倍。在棉花幼苗上的实验结果与叶片上一致,ΔVdEf36侵染的棉花幼苗病情指数为3和4的植株占整体的50%,而V991侵染的棉花幼苗病情指数为3和4的植株占整体的28%。表明敲除VdEf36以后,大丽轮枝菌对棉花的致病力得到了提高。7)VdEf36引起棉花水杨酸（salicylic acid,SA）途径和乙烯（ethylene,ET）途径关键防御基因的上调在ΔVdEf36突变体和野生型V991侵染棉花根部12 h、24 h、36 h、48 h后收集棉花根部,利用RT-PCR测定防御基因的表达变化。与接种野生型菌株的植株相比,ΔVdEf36侵染棉花根部PR1、PR2、PR4等SA途径和ET途径关键性防御基因的表达量均被下调。其中,PR1基因的表达量下调73%,PR3基因表达量下调67%,PR4基因下调56.4%。这表明VdEf36可以引起棉花这些防御基因表达的上调。综上,VdEf36在大丽轮枝菌侵染宿主过程中特异性表达,并被递送到宿主植物细胞核而发挥其作用;VdEf36可以被植物所识别并引起强烈的防御响应,引起SA和ET信号途径的关键防御基因的表达,敲除VdEf36以后,大丽轮枝菌的致病力提高。