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研究背景与目的喉癌（Laryngeal Squamous Cell Carcinoma,LSCC）是耳鼻咽喉科常见恶性肿瘤,发病率近年来有明显增高趋势,目前对喉癌的治疗主要是手术为主,辅以放疗、化疗和免疫治疗。但手术、放疗和化疗并发症多,毒副作用大,病人的生活质量并不高。因此寻找新的有效、简便、毒副作用小的治疗方法成为众多研究者关注的热点。RNA干扰（RNA interference,RNAi）,也成为RNA沉默,是mRNA在双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）的介导下引起降解的现象,是生物体进化过程中的保守机制。该技术近几年来成为基因治疗研究的热点。在癌症研究方面,它可以特异性地结合目的基因的mRNA,干扰其转录、翻译形成蛋白质,抑制癌蛋白的生成,使癌细胞向成熟方向分化或诱导癌细胞凋亡,从而达到肿瘤基因治疗的目的。喉癌和其它肿瘤一样,其发生是一种多基因、多步骤的发生过程,发病机制复杂,细胞的过度增殖及凋亡受阻是其发生发展的基础。国内外大量文献表明,Jab1基因在癌症的发生发展中有重要作用。Jab1即C-Jun激活区域-连接蛋白1（C-Jun activation domain-binding protein 1,Jab1）,是COP9信号复合体（COP9signalosome regulatory complex,COP9）的第5个亚单位,是细胞内的可溶性蛋白,在生物体内高度保守。细胞周期素依赖激酶抑制因子(p27kip1蛋白),是一个细胞周期负调节物,可以抑制细胞周期由G1期向S期过渡。在人类肿瘤中p27kip1的变异非常少见,p27kip1的调节主要是在在转录后水平,p27kip1蛋白主要在细胞核内发挥作用。在喉癌方面,国内外有关Jab1基因的研究少有报道。本实验通过脂质体2000将Jab1siRNA导入喉癌Hep-2细胞中,使Jab1基因的表达受到抑制,并通过不同的方法来观察Jab1siRNA对喉癌细胞Jab1基因的表达、细胞增殖和凋亡的影响。方法1.采用免疫组化方法检测人50例喉鳞状细胞癌组织和10例癌旁正常组织中Jab1和p27kip1的表达。2.采用细胞免疫荧光方法检测喉癌Hep-2细胞中Jab1和p27kip1的表达。3.通过Lipofectamrne2000将Jab1siRNA导入喉癌Hep-2细胞,抑制Jab1基因的表达,通过四甲基偶氮唑蓝（也成为噻唑蓝）光吸收法（MTT法）,检测Jab1siRNA在不同浓度、不同时间对Hep-2细胞增殖的影响。4.通过RT-PCR法检测Jab1 siRNA转染Hep-2细胞后,Jab1基因和p27kip1基因的表达情况。5.通过流式细胞术进行细胞凋亡分析。用相同浓度的Jab1siRNAⅡ（100nm/L）转染Hep-2细胞0、24、48、72小时后,进行Annexin-VFITC和PI染色,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。6.应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。采用卡方检验和Fisher’s精确概率法进行显著性检验,相关分析采用Spearman相关性分析,多样本均数比较应用单因素方差分析,检验水准α=0.05。结果1.人喉鳞状细胞癌组织免疫组化方法检测结果:两种蛋白的阳性表达均为细胞核中出现棕褐色颗粒。Jab1在人喉鳞癌组织中高表达,正常喉黏膜中不表达或弱表达:p27kip1在人喉癌组织中弱表达,在正常喉粘膜中强表达;表明Jab1和p27kip1基因的表达与喉癌的发生关系密切。2.细胞免疫荧光结果:Jab1和p27kip1蛋白在喉癌Hep-2细胞中均有表达。3.RT-PCR扩增结果:在Hep-2细胞中有Jab1和p27kip1mRNA的表达;Jab1siRNAⅡ可降低Jab1 mRNA表达,并且随着时间的延长,Jab1 mRNAⅡ在Hep-2细胞中的表达逐渐减弱,而p27kip1的mRNA的表达则无明显变化。Jab1siRNAⅡ对Hep-2细胞Jab1基因的mRNA表达的抑制效果,比Jab1siRNAⅠ和Jab1 siRNAⅢ的抑制效果明显。4.噻唑蓝光吸收法（MTT）结果:Jab1siRNAⅡ转染后的Hep-2细胞与对照组细胞相比,SDH活性之间的差异有统计学意义（P＜0.05）。5.流式细胞技术检测结果:Hep-2细胞在Jab1 siRNAⅡ的作用下,随着作用时间的延长,细胞凋亡率逐渐升高,差异显著（P＜0.05）。结论1.Jab1在人喉鳞癌组织中表达增强,正常喉黏膜中不表达或弱表达;p27kip1在人喉癌组织中弱表达,在正常喉粘膜中强表达;两者在喉癌中的表达呈负相关。表明Jab1和p27kip1基因的表达与喉癌的发生关系密切。2.在Hep-2细胞中Jab1和p27kip11蛋白均有表达。3.Jab1 siRNAⅡ转染Hep-2细胞后,Jab1 mRNA表达水平明显下降,细胞增殖受到抑制,其抑制作用有时间依赖性和剂量依赖性。Jab1 siRNAⅡ有促进喉癌细胞细胞凋亡作用。4.Jab1基因及其表达产物可成为喉癌生物治疗的有效基因靶点。