内毒素血症主要是由革兰氏阴性细菌感染引起,革兰氏阴性细菌通过增殖、释放内毒素,从而引起组织损伤,甚至造成多器官功能障碍综合症。到目前为止,内毒素血症依然是重症监护病房中造成病人死亡的主要原因之一。但是,与其他感染性疾病不同,对于内毒素血症的治疗并非特异性的,仅限于器官功能支持治疗和通过输液、抗感染和吸氧等。因此,对于内毒素血症的发病机制研究,为其治疗提供理论依据和治疗策略显得非常重要。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁外层的主要结构,是一个含大量脂质和多糖的结构。脂多糖通过与其天然免疫模式识别受体Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)结合后,脂多糖能够促使大量的炎症因子释放,如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)等。研究认为,LPS介导TNF-α生成的主要经典信号通路是LPS通过TLR4/MAPKs/NF-κB/TNF-α信号通路。最近几年的研究发现,LPS能够转激活表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor, EGFR)。表皮生长因子受体属于受体酪氨酸激酶家族,在体内大部分细胞中都有表达,而且表皮生长因子受体EGFR在细胞增殖、分化和肿瘤生长等方面起到非常重要的作用。研究表明,在慢性气道疾病中,LPS引起的气道炎症过程中可以使炎症因子,例如IL-1, IL-6等,而LPS刺激炎症因子的作用依赖于对EGFR的激活。同时,Kuper C及其同事们在对肾脏集合管细胞的研究中发现,LPS转激活EGFR需要通过TNF-α转化酶(TNF-a-converting enzyme, TACE),最终会引起环氧酶2(cyclooxygenase2, COX2)产生。目前的这些研究表明,在LPS引起的内毒素血症中,EGFR的激活可能也会起到重要作用。在内毒素血症中,过量释放炎症介质使内毒素血症患者发展为多器官功能衰竭存在更高的风险,也是内毒素血症患者高死亡率的重要原因。相关研究发现前炎症因子TNF-α是造成内毒素血症心肌损伤的主要因素,而心肌细胞也是产生TNF-α的主要场所。β-arrestins作为一种衔接蛋白,在G蛋白复合物受体(G protein-coupled receptor,GPCR)脱敏中起到重要作用,同时β-arrestins在调控TLR信号通路和前炎症因子基因表达中也起到重要作用。有研究发现膜相关的GPCR/α-arrestins/c-Src复合物可以转激活EGFR,然后进一步激活下游信号通路,如PI3K/Akt和Ras/Raf/MAPK/ERK信号通路,最后引起分化和增殖。目前没有关于EGFR对于调控内毒素血症中心肌TNF-α生成的相关研究,同样对于在炎症中起到重要调节作用的β-arrestin 2有没有参与LPS转激活EGFR也没有相关报道。本实验,通过培养原代心肌细胞以及在野生型C57BL/6小鼠和β-arrestin 2基因敲除C57BL/6小鼠上,从细胞水平和在体水平,探讨转激活EGFR是否能够对内毒素血症中心肌组织或心肌细胞产生TNF-α有影响,另外P-arrestin 2是否也会对LPS转激活EGFR起到作用。材料和方法1.动物准备与模型制备SPF级C57BL/6雄性小鼠,6-8周龄,体重22-25g,购于南方医科大学实验动物中心。β-arrestin2基因敲除小鼠购于Jackson实验室后在南方医院动物中心进行繁殖。小鼠饲养在南方医院实验动物中心：条件：室温25-27℃,湿度50%-70%,5只/笼,自由摄取食物和水,早晚定时进行灯光变换,避免强光、噪音刺激。本实验通过腹腔注射LPS (5mg/kg)制成内毒素模型小鼠。2.原代心肌细胞培养使用D-Hanks稀释的高纯度胶原酶Liberase TH (Roche, Cat.# 11988468)稀释到22.5μg/ml用于消化心脏组织。将新生小鼠心脏置于10ml无菌离心管中剪碎,用D-Hanks液平衡、清洗两次后,于22.5μg/ml的Liberase TH中37℃预消化10 min,弃上清。再加入3ml左右的Liberase TH于37℃消化15min,每隔2min左右轻柔震荡一次。收集上清,800×g,5min离心得到心肌细胞,使用M199+10%胎牛血清+1%青链霉素重悬细胞。另外将剩下的心脏组织再次加入3m1左右的Liberase TH于37℃消化15min,用同样的方法离心、重悬心肌细胞(必要时,还可以将剩下的心脏组织进行第三次消化)。将两次得到的心肌细胞混合在一起并预种植于10cm细胞培养皿中,培养45-60min。随后使用移液器轻柔吹洗细胞,并过滤于50m1离心管中,取101μl计数,按照每孔50×104的密度,接种于24孔板中(24孔板预先使用1%的明胶封板1h,随后吸弃明胶,并于室温中干燥后使用),在M199+10%胎牛血清+1%青链霉素中培养24h后实验。3.实验过程3.1 PD168393和厄洛替尼对LPS转激活EGFR的影响首先,在体外培养原代心肌细胞,原代心肌细胞分为6组：对照组：原代心肌细胞中加入盐水；PD168393组：原代心肌细胞中加入PD168393使其终浓度为50μM；厄洛替尼组：原代心肌细胞中加入厄洛替尼使其终浓度为20μM；LPS组：原代心肌细胞中加入浓度为4μg/ml的LPS；LPS+PD168393组：原代心肌细胞中先加入终浓度为50μM的PD168393,0.5小时后加入浓度为4μg/ml的LPS；LPS+厄洛替尼组：原代心肌细胞中先加入终浓度为20μM的厄洛替尼,0.5小时后加入浓度为4μg/ml的LPS。经过上述处理后,于0.5小时后收集细胞,用western blot的方法检测磷酸化的EGFR和EGFR情况。其次,进行在体实验研究。16只野生型C57BL/6小鼠随机分为对照组、厄洛替尼组、LPS组和LPS+厄洛替尼组,每组4只。对照组：腹腔注射生理盐水；厄洛替尼组：厄洛替尼(45mg/kg)灌胃3天；LPS组：腹腔注射LPS (5mg/kg);LPS+厄洛替尼组：厄洛替尼(45mg/kg)灌胃3天,第4天腹腔注射LPS(5mg/kg)。各组小鼠于LPS处理1小时后取心脏组织进行western blot检测磷酸化EGFR和EGFR的情况。3.2研究抑制EGFR磷酸化对LPS介导的TNF-α生成是否有影响首先,在体外培养原代心肌细胞,原代心肌细胞分为9组：对照组：原代心肌细胞中加入盐水；厄洛替尼20μM组：原代心肌细胞中加入厄洛替尼使其终浓度为20μM；PD16839350nM组：原代心肌细胞中加入PD168393使其终浓度为50μM；LPS组：原代心肌细胞中加入浓度为4μg/ml的LPS；LPS+PD168393组：原代心肌细胞中加入PD168393使其终浓度为2μM预处理30min后加入浓度为4μg/ml的LPS；LPS+PD168393 10μM组：原代心肌细胞中加入PD168393使其终浓度为10μM预处理30min后加入浓度为4μg/ml的LPS；LPS+PD168393组：原代心肌细胞中加入PD168393使其终浓度为50μM预处理30min后加入浓度为4μg/ml的LPS；LPS+厄洛替尼10μM组：原代心肌细胞中加入厄洛替尼使其终浓度为10μM预处理30min后加入浓度为4μg/ml的LPS；LPS+厄洛替尼20μM组：原代心肌细胞中加入厄洛替尼使其终浓度为20μM预处理30min后加入浓度为4μg/ml的LPS；各组分别于LPS处理后4小时用RT-PCR的方法检测TNF-α的mRNA水平,用ELISA的方法检测培养液中TNF-α的蛋白水平。其次,我们进行了在体实验,16只野生型C57BL/6小鼠随机分为对照组、厄洛替尼组、LPS组和LPS+厄洛替尼组,每组4只。对照组：腹腔注射生理盐水；厄洛替尼组：厄洛替尼(45mg/kg)灌胃3天；LPS组：腹腔注射LPS (5mg/kg);LPS+厄洛替尼组：厄洛替尼(45mg/kg)灌胃3天,第4天腹腔注射LPS(5mg/kg)。各组小鼠于LPS处理6小时后取心脏组织进行ELISA法检测TNF-α的蛋白水平。3.3 LPS转激活EGFR后调控磷酸化的ERK1/2和p38的研究按照上述方法分离、培养原代心肌细胞。原代心肌细胞分为6组：对照组：原代心肌细胞加入盐水；厄洛替尼组：原代心肌细胞中加入终浓度为20μM的厄洛替尼；PD168393组：原代心肌细胞中加入终浓度为50μM的PD168393；LPS组：原代心肌细胞浓度为4μg/ml的LPS；LPS+厄洛替尼组：原代心肌细胞中加入厄洛替尼使其终浓度为20μM预处理30min后加入浓度为4μg/ml的LPS；LPS+PD168393组：原代心肌细胞中加入PD168393使其终浓度为50μM预处理30min后加入浓度为4μg/ml的LPS；LPS处理后1.5小时收集细胞,用western blot的方法检测磷酸化p38,磷酸化ERK1/2的情况。其次,我们进行了体内实验。16只野生型C57BL/6小鼠随机分为对照组、厄洛替尼组、LPS组和LPS+厄洛替尼组,每组4只。厄洛替尼组和LPS+厄洛替尼组首先于每日上午8：00至11：30通过灌胃方式给予厄洛替尼(45mg/kg),连续灌胃3天。对照组和LPS组不做此处理。随后第四天,对照组给予腹腔注射生理盐水处理,LPS组和LPS+厄洛替尼组于腹腔注射LPS (5mg/kg)。对照组：腹腔注射生理盐水；厄洛替尼组：厄洛替尼(45mg/kg)灌胃3天；LPS组：腹腔注射LPS (5mg/kg);LPS+厄洛替尼组：厄洛替尼(45mg/kg)灌胃3天,第4天腹腔注射LPS(5mg/kg)。各组小鼠于LPS处理2小时后取心脏组织进行western blot法检测磷酸化ERK1/2,磷酸化p38水平。304.研究β-arrestin 2对LPS介导心肌细胞合成TNF-α的影响为了研究P-arrestin 2在LPS介导的TNF-α的合成中的作用,我们应用β-arrestin 2基因敲除小鼠进行研究。实验分组和操作步骤如下：对照组：野生型C57BL/6小鼠,腹腔注射生理盐水；β-arrestin 2+-/-组：β-arrestin 2基因敲除杂合子小鼠,腹腔注射生理盐水；β-rrestin 2-/-组：β-arrestin 2基因敲除纯合子小鼠,腹腔注射生理盐水；LPS组：野生型C57BL/6小鼠,腹腔注射LPS (5mg/kg);LPS+β-arrestin 2+/-组：β-arrestin 2基因敲除杂合子小鼠,腹腔注射LPS(5mg/kg);LPS+β-arrestin 2-/-组：β-arrestin 2基因敲除纯合子小鼠,腹腔注射LPS(5mg/kg);各组小鼠于LPS处理后6小时取心脏组织用RT-PCR和ELISA的方法检测TNF-α蛋白水平。3.5.研究β-arrestin 2对转激活EGFR的作用如果β-arrestin 2和EGFR都会对心脏组织合成TNF-α起到作用,那么β-arrestin 2是否也参与LPS介导的转激活EGFR?我们进行了以下研究：对照组：野生型C57BL/6小鼠,腹腔注射生理盐水；β-arrestin 2+/组：β-arrestin 2基因敲除杂合子小鼠,腹腔注射生理盐水；β-arrestin 2-/-组：β-arrestin 2基因敲除纯合子小鼠,腹腔注射生理盐水；LPS组：野生型C57BL/6小鼠,腹腔注射LPS(5mg/kg)；LPS+β-arrestin 2+/-组:β-arrestin 2基因敲除杂合子小鼠,腹腔注射LPS(5mg/kg)；LPS+β-arrestin 2-/-组：β-arrestin 2基因敲除纯合子小鼠,腹腔注射LPS(5mg/kg)；LPS处理后1小时、2小时取心脏组织,用western blot的方法检测磷酸化EGFR(1小时),磷酸化p38及磷酸化ERK1/2(2小时)的水平。3.6研究抑制EGFR磷酸化对于小鼠心功能的影响C57BL/6小鼠分为对照组、厄洛替尼组、LPS组、LPS+厄洛替尼组,通过超声心动图检查小鼠心功能。对照组：野生型C57BL/6小鼠,腹腔注射生理盐水；厄洛替尼组：野生型C57BL/6小鼠,厄洛替尼(45mg/kg)灌胃3天；LPS组：野生型C57BL/6小鼠,腹腔注射LPS(5mg/kg);LPS+厄洛替尼组：野生型C57BL/6小鼠,厄洛替尼(45mg/kg)灌胃3天,第4天腹腔注射LPS(5mg/kg)。LPS处理后6小时进行小鼠超声心动图检查小鼠心率、心输出量、射血分数、左室短轴缩短率和每搏量变化。3.7.EGFR抑制剂厄洛替尼对内毒素血症小鼠生存率的影响C57BL/6小鼠随机分为对照组、厄洛替尼组、LPS组和LPS+厄洛替尼组。对照组：腹腔注射生理盐水；厄洛替尼组：厄洛替尼(45mg/kg)灌胃3天；LPS组：腹腔注射LPS(5mg/kg);LPS+厄洛替尼组：厄洛替尼(45mg/kg)灌胃3天,第4天腹腔注射LPS(5mg/kg)。给予正常饮食和水,观察3天后小鼠的生存情况。结果1.PD168393和厄洛替尼可以有效抑制LPS介导的EGFR磷酸化我们发现在体外实验中,原代心肌细胞中给予LPS(4μg/ml)处理0.5小时后可以转激活EGFR,而给予PD168393(50μM)或厄洛替尼(20μM)预处理后可以抑制EGFR的激活((p<0.05))。进一步我们在体内实验中,同样观察到LPS刺激后可以转激活EGFR,而在厄洛替尼预处理组可以抑制EGFR的转激活((p<0.05))。说明在体内和体外,LPS可介导心肌细胞EGFR激活,且LPS介导的EGFR激活可以部分被EGFR可逆性抑制剂厄洛替尼和非可逆性抑制剂PD168393所拮抗。2.抑制EGFR磷酸化可以降低LPS介导的TNF-α的合成我们在体外培养原代心肌细胞,并分别给予不同浓度的特异性EGFR磷酸化抑制剂PD168393(非可逆性)或者厄洛替尼(可逆性)预处理30min,我们发现LPS刺激后,TNF-α的mRNA和蛋白合成显著增加,而预先给予PD168393或厄洛替尼处理30min的原代心肌细胞与LPS组相比,可以显著降低TNF-α的mRNA和蛋白水平(p<0.05)。而随着抑制剂浓度的提高,对于TNF-α的mRNA和蛋白合成的抑制作用也相应增加。而在体内实验中,我们同样发现与LPS组相比,预先给予抑制剂处理的小鼠心肌细胞中的TNF-α的mRNA和蛋白合成是显著下降的(p<0.05)。3.LPS转激活EGFR调控ERK1/2和p38的磷酸化我们在体外实验中检测原代心肌细胞在LPS、PD168393、厄洛替尼不同处理后的ERK1/2和p38磷酸化水平,我们发现在体外实验中,LPS刺激原代心肌细胞1小时后可以观察到ERK1/2和p38的磷酸化,而预先给予PD168393或厄洛替尼处理的心肌细胞再接受LPS刺激时,LPS刺激引起的ERK1/2和p38磷酸化水平下降了。相应的在体内实验中,LPS刺激后,小鼠心脏组织出现ERK1/2和p38磷酸化,而预先给予抑制剂厄洛替尼后,我们发现LPS刺激引起的ERK1/2和p38磷酸化被抑制了。这充分说明ERK1/2和p38参与了LPS介导的心肌细胞TNF-α的产生。4.β-arrestin 2能够调节LPS介导的心肌组织TNF-α的合成在LPS引起的内毒素血症中,我们发现β-arrestin 2基因敲除小鼠与野生型小鼠相比,心肌组织中TNF-α的合成是下降的(p<0.05)。而基因敲除的纯合子与杂合子相比,心肌组织中TNF-α的水平下降的更明显。这说明β-arrestin 2参与调节LPS介导的心肌组织中TNF-α的合成。5.LPS转激活EGFR需要β-arrestin 2我们采用野生型C57BL/6小鼠、β-arrestin 2基因敲除C57BL/6小鼠制成内毒素血症模型进行研究,结果发现,LPS刺激后,β-arrestin 2基因敲除组小鼠与野生型组小鼠相比,磷酸化的EGFR水平下降了,同样的β-arrestin 2基因敲除后,下游信号分子磷酸化ERK1/2和磷酸化p38的水平是下降的这说明在LPS转激活EGFR和下游信号通路的过程中是非常重要的。6.抑制EGFR磷酸化显著减轻内毒素小鼠的心功能损害小鼠超声心动图结果显示C57BL/6小鼠厄洛替尼灌胃3天处理组与对照组相比,心输出量、左室射血分数、左室缩短分数和每搏量显著升高(p<0.05)。这说明抑制EGFR磷酸化能够显著提高左室射血功能,减轻LPS所致的心功能损害。7.抑制EGFR的激活可以提高LPS介导的内毒素野生型C57BL/6小鼠的生存率通过不同分组处理C57BL/6小鼠,发现LPS处理24小时后,观察到盐水对照组大约48%小鼠死亡,而厄洛替尼预处理组小鼠的死亡率大约为32%,72小时后,厄洛替尼预处理组生存率为52%,与LPS处理组(生存率大约只有16%)是显著提高的,说明预先给予EGFR抑制剂抑制EGFR的磷酸化能够显著提高内毒素小鼠的生存率(p<0.05)。结论我们的研究证明,在内毒素血症中,LPS转激活EGFR对调节心脏来源的TNF-α的mRNA和蛋白水平起到重要作用。通过使用EGFR抑制剂PD168393或者厄洛替尼抑制EGFR的磷酸化,可以降低LPS刺激引起的p38和ERK1/2的磷酸化。LPS刺激后β-arrestin 2基因敲除组小鼠,与对照组相比磷酸化EGFR及其下游信号通路中的p38和ERK1/2的磷酸化是下降的,说明LPS转激活EGFR需要β-arrestin 2参与。厄洛替尼抑制内毒素血症小鼠心肌的EGFR激活能够有效改善左心室射血功能和改善心功能障碍,提高小鼠生存率。这些结果提供了EGFR在内毒素血症心肌TNF-α生成之间的联系,也为临床治疗内毒素血症提供新的方向。