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目的研究重组人心肌肌钙蛋白T (Human cardiac troponin T, hcTnT)在大肠杆菌中的表达及纯化,为进一步制备cTnT单克隆抗体及开发稳定性良好的hcTnT检测试剂盒奠定基础。方法1.重组蛋白在大肠杆菌中的表达：将含有hcTnT基因片段的重组质粒pET-15b-cTNNT2转入大肠埃希氏菌BL21(DE3)中表达,接种于含氨苄青霉素的LB琼脂培养基,在对诱导剂IPTG的诱导浓度及诱导时间优化之后,将细菌裂解后的上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳,鉴定重组蛋白是否在BL21(DE)中正常表达及其表达量,以及确定重组蛋白的可溶性。2.纯化重组蛋白：重组蛋白质的N末端含有一个六个组氨酸的亲和标记,可以和金属螯合物结合从而使重组蛋白和其他杂蛋白分离,纯化目的蛋白。本实验中重组蛋白在流过Ni-NTA柱后与柱上的镍原子结合,非标记蛋白随流出液流出,经过洗脱液洗去大部分杂蛋白,最后可以得到纯度较高的重组蛋白。3. Western-blot鉴定纯化后的蛋白是否为重组目的蛋白。结果1.重组质粒pET-15b-cTNNT2成功转入大肠埃希氏菌BL21(DE3)中,经过IPTG诱导后获得了较高的表达,用Bandscan5.0软件检测发现重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的8%左右。使用罗氏公司Cobas E411电化学发光全自动免疫分析仪检测也发现细菌裂解液中有高浓度的肌钙蛋白T。2.利用镍凝胶柱亲和层析法纯化重组蛋白,得到了纯度较高的重组蛋白。3.纯化得到的蛋白,经过Western blot鉴定,在37KD附近有特异性着色带,与SDS-PAGE中重组蛋白的深染条带位置相一致,初步证明得到的纯化蛋白为重组hcTnT蛋白。结论1.利用基因工程技术在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中成功表达重组hcTnT蛋白。2.利用镍凝胶柱亲和层析法纯化得到了纯度较高的重组hcTnT蛋白。