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目的慢性牙周炎(chronic periodontitis)是临床常见的以牙周支持组织进行性破坏为主要病理变化的一种慢性炎症性疾病。现有的治疗策略只能控制疾病的进展,并不能实现破坏牙周组织的完全再生。应用原位组织工程的原理,动员自身足量的功能细胞至牙周缺损区并促进其定向分化,有望成为牙周组织再生的新策略。碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是原位组织工程中最有潜力的生长因子之一,我们的前期研究发现其可以促进多种间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖和迁移。骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)则具有极大的成骨潜能。目前bFGF与BMP-2应用的研究多趋于二者同时联合应用,并不符合组织再生的进程。因而本研究采用bFGF与BMP-2序贯应用,立足组织再生的进程,于伤口愈合的早期应用bFGF募集足量功能性干细胞,晚期应用BMP-2最大化促进其定向成骨分化。据此本研究通过体外实验构建bFGF与BMP-2序贯应用体系,探讨其对人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)增殖、迁移及成骨分化的作用,为牙周组织再生提供新的思路与实验依据。方法收集临床因正畸需要拔除的健康前磨牙,通过有限稀释法分离培养获得人PDLSCs,通过克隆形成实验检测其干细胞特性,通过流式细胞术检测人PDLSCs细胞表面干细胞标志物的表达。通过细胞活力检测试剂盒(cell counting kit 8,CCK8),transwell实验测定bFGF对人PDLSCs的最佳作用浓度。通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测试测定BMP-2对人PDLSCs的最佳作用浓度。通过ALP活性测试初步构建bFGF与BMP-2序贯应用体系。通过茜素红(Alizarin red)染色法、氯代十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride,CPC)比色法、实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法(western blot)检测不同序贯应用体系对人PDLSCs的ALP活性、钙盐沉积、成骨相关基因和蛋白表达水平的影响。实验数据采用GraphPad Prism 6.0软件包进行单因素方差分析,统计结果以均数(mean)±标准差(standard deviation,SD)表示,P<0.05具有统计学意义。结果1.人PDLSCs分离培养与干细胞特性鉴定:通过有限稀释法成功分离培养获得人PDLSCs,体外培养的原代细胞具有成纤维细胞的典型特征,形态良好。克隆形成实验结果表明人PDLSCs具有克隆形成能力,流式细胞术结果表明人PDLSCs表面间充质源性干细胞表面标志物CD29、CD44和CD73表达阳性,造血源性干细胞表面标志物CD45表达阴性。2.bFGF能促进人PDLSCs的增殖能力:CCK8结果表明,与空白对照组相比,50 ng/mL bFGF对人PDLSCs的增殖具有明显的促进效应(P<0.001);Transwell实验结果显示,与空白对照组相比,各浓度bFGF均可促进人PDLSCs的迁移(P<0.001),其中50 ng/mL bFGF具有最强的促进效应(P<0.001)。3.BMP-2能提升人PDLSCs的ALP活性:ALP活性测试结果表明,成骨诱导6 d,与成骨诱导组相比,50 ng/ml BMP-2可显著提升人PDLSCs的ALP活性(P<0.001)。4.bFGF与BMP-2序贯应用能促进人PDLSCs成骨分化:成骨诱导12 d,与成骨诱导组相比,bFGF以时间依赖的方式抑制人PDLSCs的ALP活性(P<0.001);二者序贯应用的最佳模式为25 ng/ml bFGF先应用3 d,50 ng/ml BMP-2随后应用9 d,可显著提升人PDLSCs的ALP活性(P<0.001);Alizarin red染色和CPC比色结果表明,25 ng/ml bFGF应用3 d,50 ng/ml BMP-2随后应用18或25 d,可以最大促进人PDLSCs矿化结节形成(P<0.00l);qRT-PCR结果表明,25 ng/ml bFGF先应用3 d,50 ng/ml BMP-2随后应用9、18或25 d,可显著上调成骨相关标志物ALP、runt相关转录因子2(runt related transcription factor 2,Runx2),骨桥蛋白(osteopontin,OPN),骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)和骨钙素(osteocalcin,OCN)的基因表达水平(P<0.05);Western blot结果表明,25 ng/ml bFGF先应用3 d,50 ng/ml BMP-2随后应用18或25d,可显著上调成骨相关标志物ALP和Runx2的蛋白表达水平(P<0.001)。结论1.通过有限稀释法成功分离培养获得人PDLSCs。2.50 ng/mL bFGF显著促进人PDLSCs的增殖与迁移,以时间依赖的方式抑制人PDLSCs的ALP活性。50ng/ml BMP-2可显著提升人PDLSCs的ALP活性。3.bFGF和BMP-2序贯应用通过上调ALP活性、钙盐沉积、成骨相关基因和蛋白的表达来促进人PDLSCs成骨分化。其中25 ng/mL bFGF早期应用3 d可募集足量的功能性干细胞,50ng/mLBMP-2随后应用可促进其成骨分化。实验结果提示bFGF和BMP-2序贯应用有望促进牙周组织再生,具有良好的应用前景。