论文部分内容阅读
研究背景及目的目前临床治疗缺血性心脏病（IHD）的方法主要是常规药物治疗和血运重建治疗（经皮冠状动脉介入治疗、冠脉搭桥术等）。然而,即使接受药物或血运重建治疗的患者仍会出现反复心绞痛或心力衰竭等症状,而基因疗法在增加侧支血管生长,减少心肌缺血方面显示出较大潜力,是IHD治疗的希望。血管内皮生长因子（VEGF165）已被证明在心肌梗死后能发挥抗心肌细胞凋亡、诱导干细胞参与缺血心肌的修复以及提高心电稳定性等作用。因此,本研究选择VEGF165作为IHD基因治疗的靶基因。在基因载体的选择上,腺相关病毒（AAV）,因为免疫原性低、安全性高、组织特异性好、宿主范围广以及可介导外源基因长期稳定表达等优点,从几种病毒载体中脱颖而出,成为IHD最有前景的基因治疗载体。本研究中,我们选定具有心肌嗜性的血清型AAV9,联合心肌特异性的c Tn T启动子来介导VEGF165基因在心肌的长期稳定表达,以发挥持久有效的心肌保护作用。同时,重组腺相关病毒（rAAV）的规模化包装和纯化是制约rAAV药物研究快速发展的一个关键问题,存在着生产成本高、操作复杂、成品纯度差、回收率低以及空壳病毒较多等诸多问题。所以,本研究拟构建用于IHD基因治疗的携带VEGF165基因的心肌特异性重组腺相关病毒载体（rAAV9-c Tn T-VEGF165-e GFP）,并探索出一套简单有效、可规模化的rAAV制备纯化方法。研究方法本课题的研究方法主要包括:1)通过基因工程手段构建重组载体质粒p AAV-c Tn T-VEGF165-e GFP,并通过菌落PCR和基因测序验证载体上VEGF165基因的DNA序列,再通过Western Blots（WB）验证VEGF165基因的表达情况;2)提取足量的三种质粒（p AAV-c Tn T-VEGF165-e GFP,p AAV-R2C9,p Helper）,运用质粒共转染法进行rAAV的包装,使用荧光显微镜评估病毒包装效率,通过WB对包装的rAAV病毒进行验证;3)应用阳离子交换层析法对收获处理后的病毒液进行纯化,包括第Ⅰ轮较高p H下的除杂纯化和第Ⅱ轮以严格密集梯度洗脱为特点的进一步纯化。通过SDS-PAGE和WB对纯化产物进行蛋白分析,使用Q-PCR测定病毒滴度,最后再通过透射电镜对病毒颗粒进一步验证和分析。结果1)菌落PCR和基因测序结果提示重组质粒p AAV-c Tn T-VEGF165-e GFP构建成功,且插入的VEGF165基因序列正确;WB结果证明VEGF165能正常表达;2)荧光显微镜观察到病毒包装效率较高,可达70%-80%;WB结果证明rAAV病毒被成功包装;3)SDS-PAGE结果表明病毒纯化效果显著,第一轮纯化除去了大量蛋白杂质,第二轮纯化也明显除去部分杂质;WB和电镜结果证明,纯化产物实为rAAV病毒,经Q-PCR测得病毒的滴度可达2.15×1012GC/m L,而且电镜进一步观察到我们制备的成品病毒颗粒中空壳含量极少,包含基因的实心颗粒占比可达99%。结论本研究成功制备出携带VEGF165基因的心肌特异性rAAV基因治疗载体（rAAV9-c Tn T-VEGF165-e GFP）,并且开发了一种简单有效基于阳离子交换层析的可规模化rAAV纯化方法。