中药抗哮喘活性化合物的筛选和药理机制研究

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哮喘是一种慢性变态反应气道炎症性疾病。目前世界范围内哮喘患者总人数已达到约3亿人,由于哮喘发病率不断的增高,预计在未来15-20年内患者总人数将增至4亿人。由于哮喘属于慢性炎症性疾病,需要长期或终身治疗,对临床疗效的预测比较困难。中医中药治疗哮喘有悠久的历史,并且针对哮喘的慢性和需长期治疗的特点,中药在临床治疗上发挥了很大的优势,积累了丰富的临床经验。但由于对中医疗法机理方面的研究尚不够深入和系统,大多数中药的研究仅限于临床疗效观察,动物实验研究较少,分子和细胞水平的研究更加缺乏,复方中药发挥疗效的有效成分、作用方式、途径和靶点等机理尚不清楚,临床用药也缺少相应的药物作用机理作为指导。β2肾上腺素受体(β2-adrenergic recptor,β2-AR)激动剂是目前临床应用最广、种类最多的支气管解痉剂之一,可有效地缓解哮喘的急性症状。本论文首先将β2-AR基因转入含环式腺苷一磷酸反应元件(cyclic adenosinemonophosphate response element,cAMP response element,CRE)调节绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)报告基因表达的中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞系中,构建CHOβ2-AR-CRE-GFP细胞,建立了β2-AR激动剂功能性细胞筛选体系,并利用该筛选体系对123种中药进行初筛,得到麻黄、细辛、附子、陈皮等25种具有β2-AR激动剂活性的中药材提取物。本论文以附子为例,利用所建立的β2-AR激动剂功能性细胞筛选体系结合高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)、电喷雾质谱(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)等分离纯化和分析方法,对附子提取物中所含的激动剂活性成分进行了分离和鉴定。阐明了去甲乌药碱是附子中的β2-AR激动剂活性成分,并在气管平滑肌离体模型和豚鼠哮喘模型中证明了去甲乌药碱能通过激活β2-AR有效的舒张气道平滑肌,延长组胺诱导的哮喘潜伏期,缓解哮喘。临床研究表明,糖皮质激素与β2-AR激动剂组合治疗是目前改善肺功能,控制症状和抑制病情恶化最有效的方法。本论文研究发现甘草的主要成分——甘草酸具有类似糖皮质激素的功能,可以与β2-AR激动剂发挥协同作用,促进β2-AR mRNA水平升高、保护受体蛋白,提高细胞内cAMP的水平,增强β2-AR的细胞信号传导;将β2-AR激动剂和甘草酸联用对NF-κB相关炎症具有增强的抑制作用,可以通过其抑制Ⅰ-κBα蛋白降解,调控肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)引起的NF-κB启动子活性,抑制人支气管平滑肌细胞(human bronchial smooth muscle cell,HBSMC)和肺上皮A549细胞中白介素-8(interleukin-8,IL-8)的分泌。同时,豚鼠离体气管平滑肌实验和豚鼠组胺诱导哮喘实验中也表明将甘草酸与β2-AR激动剂组合使用,可明显增强激动剂活性,表现出扩张平滑肌、缓解哮喘的协同增效作用。此研究结果为解释甘草在咳喘中药中的配伍机理提供了理论依据。此外,本论文还以pcDNA3.1/β2-AR质粒转染HEK293细胞构建了表达外源β2-AR的HEK293-β2-AR细胞模型。采用AnnexinV和PI双染实验证明,10μmol/L沙丁胺醇诱导HEK293-β2-AR细胞的凋亡,而甘草酸可以对沙丁胺醇诱导的早期凋亡起到抑制作用。MTT比色实验表明甘草酸抑制沙丁胺醇诱导的细胞凋亡、提高细胞存活率的作用成剂量依赖关系。DAPI染色细胞核证明甘草酸能够抑制沙丁胺醇诱导的HEK293-β2-AR细胞的核异常。对细胞凋亡基因定量PCR检测发现,甘草酸通过调节Bcl-2/BaxmRNA比率,抑制β2-AR激动剂诱导的细胞凋亡。实验结果揭示和甘草酸与激动剂组合疗法与细胞凋亡之间的关联,为研究配伍作用机制提供的新的思路和研究方向。本研究建立基于细胞的β2-AR激动剂筛选系统,应用于从中药丰富的天然化合物库中筛选新的β2-AR激动药或此类药物的先导化合物。并完善了β2-AR激动剂的提取、分离、鉴定与药理学评价的确认体系,从复方中药到单一化合物,在分子和细胞、离体组织、整体动物水平系统的研究了天然的β2-AR激动剂与甘草酸联合治疗哮喘的作用机理,阐明了部分咳喘中药的配伍关系和分子作用机理,为咳喘中药的现代化提供新的思路,为指导哮喘等疾病的治疗提供了理论支撑。
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