研究背景及目的急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）由多种传染性和无菌性病因,例如肺炎,胃内容物吸入,败血症,急性肝衰竭和急性胰腺炎等直接或间接引起肺损伤的致命疾病,发生和发展过程复杂,发病机理尚未完全阐明。潜在的发病机制可能归因于中性粒细胞积聚和促炎性细胞因子作用于肺微血管内皮细胞（PMVECs）,导致细胞间连接的破坏（例如粘附连接）,微管激活和肌动蛋白细胞骨架重塑,细胞收缩并形成间隙,炎症破坏肺微血管屏障,大量蛋白质和液体进入肺间质和肺泡腔,发生临床上严重的低氧血症性呼吸衰竭。研究表明,单一的阻断炎症介质并未取得理想效果,探究ARDS过程中相关的信号通路,阻断炎症风暴发生,是目前关注的新热点。Rac1作为小G蛋白家族一员,在稳定肌动蛋白的细胞骨架和维持微血管屏障功能方面发挥重要作用。Rac1通过促进皮质区肌动蛋白纤维束的形成来调节细胞骨架,通过连接复合物的重塑来维持细胞间连接。有证据表明,抑制Rac1可显著增加静脉微血管通透性。膜-F-肌动蛋白连接蛋白Ezrin与支架蛋白IQGAP1共定位于膜下细胞骨架,是聚集不同信号复合物的枢纽。近几年人们也开始研究它们在内皮通透性方面作用,但炎症条件下,它们究竟对细胞屏障有何影响,尚未见报道。F-肌动蛋白介导的粘附连接,是维持内皮屏障的关键因素,皮质肌动蛋白结合蛋白（cortactin）通过增加自身其在细胞皮质中的分布,促进其与皮质肌动蛋白细胞骨架的结合,从而增强粘附和紧密连接,调节细胞骨架的动力学,参与内皮屏障功能的调节。TNF-α是ARDS在疾病早期阶段分泌的主要促炎细胞因子。它通过改变内皮细胞紧密连接的结构和F-肌动蛋白的分布来破坏内皮细胞屏障的功能完整性。*本实验系国家自然科学基金资助项目（No.81770081）本研究拟通过TNF-α刺激PMVEC,破坏细胞屏障,并分别抑制Rac1、IQGAP1、Ezrin表达,观察它们在TNF-α致伤大鼠PMVEC中的作用。方法1.体外分离、培养、鉴定、传代RPMVECs。2.取已提前铺好胶的transwell小室若干,按制定的实验方案,构建相应的体外RPMVECs单层细胞模型。按照制定的实验分组给予细胞不同的刺激,检测跨内皮细胞电阻（transendothelial electrical resistance,TEER）变化和异硫氰酸荧光素标记的白蛋白（FITC-BSA）的通透性变化。3.给予不同浓度或品种试剂刺激RPMVECs,倒置荧光显微镜观察细胞骨架蛋白F-actin和cortactin的变化。4.通过western blot检测不同实验分组中Rac1、IQGAP1、Ezrin、cortactin水平改变。5.分别构建靶向Rac1、IQGAP1、Ezrin的载体质粒,并包装相应慢病毒感染RPMVECs,分别下调这三者的表达。6.分别检测下调Rac1、IQGAP1、Ezrin表达后,TEER、FITC-BSA及细胞骨架的变化。结果1.体外成功分离、培养RPMVECs（约10-14天）,经显微镜下细胞形态学、FITC-植物血凝素结合试验鉴定证实。2.通过CCK8实验发现,当TNF-α浓度为0、1、10和100 ng/m L时对PMVECs细胞活性无显著影响。测细胞通透性发现,TEER呈剂量依赖性（1-100 ng/m L）和时间依赖性（0-6 h）下降。TNF-α刺激2 h后的FITC-BSA通透率也随着TNF-α浓度升高而升高。3.原代RPMVECs感染慢病毒后,倒置荧光显微镜下48 h即可见绿色荧光蛋白（GFP）表达,72 h后GFP表达强度进一步增强。感染效率,即72 h末占初始值比例:Rac1-sh RNA 15±7%,IQGAP1-sh RNA 10±1.1%,Ezrin-sh RNA 35±3.16%,阴性对照组三种蛋白表达无显著变化。4.TNF-α（100 ng/m L）刺激PMVECs后,Rac1的活性（Rac1-GTP）以时间依赖性（0-2 h）方式显著降低,而Rac1总的表达水平却保持不变。Rac1下调,细胞的TEER降低至对照组的约57%,用TNF-α刺激2 h后,sh Rac1组细胞的TEER降至36%,而control-sh RNA组的TEER降至61%。相反,若给予8-O-Me-c AMP（200 mmo L/L）预孵育,TNF-α组的TEER增加至130%,在3 h末仍稍高于对照组。FITC-BSA渗透率也显示出相似的通透性变化。5.TNF-α作用于细胞,可见F-actin聚集,细胞外周cortactin的分布减少。无论是否暴露于TNF-α,Rac1表达受到抑制后,PMVEC细胞内均会出现高应力纤维、细胞表面的cortactin水平显著下降。经Rac1特异性激动剂O-Me-c AMP预处理的PMVECs可逆转TNF-α刺激带来的细胞骨架重排现象。6.100 ng/m L TNF-α刺激PMVECs后,IQGAP1的表达水平以时间依赖性方式降低（0-3 h）。下调IQGAP1,细胞的TEER降低至阴性对照组的78%。当TNF-α刺激2 h后,IQGAP1-sh RNA组（TNF-α+IQGAP1-sh RNA组）的TEER降至34%,而阴性对照组（TNF-α+control-sh RNA）的TEER降至66%。FITC-BSA渗透率也显示出相似的通透性变化。7.单独TNF-α或sh IQGAP1作用于细胞,F-actin聚集,细胞外周cortactin分布减少。而二者共处理,胞内高水平的应激纤维形成和细膜cortactin分布减少。Western Blot发现在sh IQGAP1转染的细胞中,细胞外周cortactin表达降低。而暴露于TNF-α,膜上的cortactin含量进一步降低。8.下调IQGAP1,细胞中Rac1-GTP的表达显著降低,TNF-α刺激2 h后,与对照组（control-sh RNA+TNF-α组）相比,在IQGAP1下调的细胞（sh IQGAP1+TNF-α组）中Rac1-GTP的减少更为明显。9.O-Me-c AMP处理sh IQGAP1转染的细胞,可逆转TNF-α诱导的TEER的增加和FITC-BSA渗透降低,减轻细胞骨架重塑和cortactin细胞内再分布10.接受TNF-α刺激后,细胞内活性Ezrin（p-Ezrin）呈时间依赖性增加,总的细胞内Ezrin的表达水平却保持不变。静息状态下,sh Ezrin组的TEER值较阴性对照组的值略低,下调Ezrin可以恢复TNF-α引起的TEER降低。而Rac1特异性抑制剂NSC23766则进一步降低TNF-α和sh Ezrin诱导的TEER降低。sh Ezrin可以抵抗TNF-α引起的FITC-BSA通透率升高,加入NSC23766后,FITC-BSA通透率再次升高。11.下调Ezrin能够显著降低TNF-α诱导RPMVECs中F-actin的聚合、应力纤维的形成及cortactin再分布,而NSC23766能抑制sh Ezrin对TNF-α致伤PMVEC细胞骨架的维护,细胞骨架再次被重塑。结论1.TNF-α在不影响细胞活力的情况下,可以引起PMVEC通透性增高。2.活性Rac1在维持细胞骨架,维护细胞通透性方面起重要作用。3.TNF-α刺激PMVECs,IQGAP1表达量减少,引起活性Rac1含量降低,F-actin及cortactin再分布,导致细胞高通透性。4.TNF-α刺激PMVECs,磷酸化Ezrin表达量增加,引起活性Rac1含量减少,F-actin及cortactin再分布,导致细胞高通透性。