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目的:本研究基于IL-22介导的角质形成细胞中miRNAs及mRNAs的差异表达,在miRNA及mRNA表达谱芯片前期研究的基础上,检测miR-548a-3p对角质形成细胞的生物学功能及其靶基因,进而从表观遗传学角度进一步探究IL-22诱导下microRNA对角质形成细胞增殖作用的分子机制。方法:(1)将人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞株)分为实验组和对照组,分别给予100 ng/ml的IL-22刺激24h和零刺激,实验重复3次。而后使用RNAiso Plus试剂提取细胞总RNA,并检测其浓度和纯度,以确保可在此后实验中使用;(2)从表达谱芯片结果中选取某目标差异miRNA,并选择U6为内参照,对此目标差异miRNA的芯片结果,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法进行验证,以2-△△Ct法计算数据相对表达量,分别进行3次独立实验;根据入选标准,选择6例寻常型银屑病患者及6例正常人对照,分别对其皮损和皮肤组织样本,采用RT-qPCR法进行rniRNA的分子表达检测,同样用2-△△Ct法表示;(3)向HaCaT细胞中,分别加入模拟物、抑制物、模拟物和抑制物的阴性对照进行转染,并实施CCK-8细胞增殖实验,以便验证该差异miRNA分子对人类角质形成细胞的生物学功能;(4)为筛选该miRNA可能调控的下游靶基因,首先对比miRNA芯片及mRNA芯片结果,取其中呈负相关的交集基因,而后查阅文献,并利用生物信息学数据库软件进行预测,综合以上结果筛选该miRNA的下游靶基因。双荧光素酶报告基因实验对筛选出的靶基因进行验证,通过检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的发光比值,以判断差异miRNA及其预测靶基因的mRNA 3’UTR端间是否发生了互补结合;(5)通过Western Blot实验检测差异miRNA过表达后靶基因蛋白的表达情况,对6例寻常型银屑病患者及6例正常人对照,分别将其皮损和正常皮肤组织制作为石蜡切片,采用免疫组织化学染色法检测该靶基因的表达情况,以确认靶基因蛋白是否对角质形成细胞具有功能。结果:(1)miRNA及mRNA表达谱芯片结果表明:表达差异2倍及以上的miRNA共20个,其中表达上调的miRNA共15个,表达下调的miRNA共5个,选定miRNA-548a-3p作为下一步的实验对象,预测miR-548a-3p的靶基因共39个;(2)RT-qPCR结果表明:IL-22刺激HaCaT细胞24h后可使miR-548a-3p表达水平显著上调约17.91倍,明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),也可使6例寻常型银屑病患者皮损中miR-548a-3p表达水平显著上调约7.63倍,差异有统计学意义(P<0.05);(3)CCK-8细胞增殖实验结果显示:转染miR-548a-3p模拟物组,HaCaT细胞增殖能力较对照组明显增强,差异有统计学意义(P<0.05),而转染miR-548a-3p抑制物组,其细胞增殖能力较对照组明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);(4)双荧光素酶报告基因实验验证靶基因PPP3R1结果显示:首先构建分别携带PPP3R1基因3’UTR区野生型或突变型的报告基因载体,按照野生型+miR-548a-3p模拟物、野生型+miR-548a-3p对照物、突变型+miR-548a-3p模拟物、突变型+miR-548a-3p对照物的分组对HaCaT细胞进行共转染,结果发现,转染PPP3R1野生型报告基因载体及miR-548a-3p模拟物组,其荧光素酶活性显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),而转染突变型报告基因载体与miR-548a-3p模拟物组,其荧光素酶活性较对照组未见明显变化,差异无统计学意义(P>0.05);(5)靶基因表达验证显示:参考生物信息学分析结果及相关文献,将PPP3R1判定为下游靶基因进行验证。免疫组织化学染色结果表明,6例寻常型银屑病患者皮损中Calcineurin B(PPP3R1所编码的蛋白)表达水平降低,明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);(6)Western Blot法验证靶基因PPP3R1蛋白表达结果显示:转染miR-548a-3p模拟物组,CalcineurinB蛋白与对照组比较表达量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果提示PPP3R1可能是miR-548a-3p的直接靶基因。结论:1.经IL-22刺激后,miR-548a-3p在角质形成细胞中表达水平上调,在寻常型银屑病患者皮损中同样显示表达水平提高;2.miR-548a-3p过表达能够明显促进HaCaT细胞增殖;3.PPP3R1很可能是miR-548a-3p的下游靶基因,miR-548a-3p可能通过调控Calcineurin B蛋白发挥促进角质形成细胞增殖的作用。