论文部分内容阅读
骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一组有不同病因但有相似生物学、形态学和临床表现的疾病,其发病机制尚不明确,是一个非常复杂的过程,系多因素相互作用的结果,与年龄、肥胖、炎症、遗传、内分泌异常、气候等因素有关。随着社会人口老龄化的加快,OA的危害越来越大。我国约有6 000万～7 000万人患有不同程度的OA。低分子肝素(low molecular weight heparin,LMWH)是糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)中结构较为复杂的一种。最新研究表明,LMWH不仅具有抗凝、抗血栓、调血脂等多种生物活性,同时还有改善局部血液循环,加速创面愈合,促进结缔组织修复、抗炎、消肿、抗过敏等功效。玻璃酸钠(sodium hyaluronate,SH)是关节滑液及软骨的重要组成成分,广泛存在于软骨多形细胞、滑膜细胞中,对关节、软骨起润滑、缓冲和屏障作用,组成和修复关节软骨。关节腔注射SH已成为OA的主要治疗方法,其能够增加关节滑液的黏弹性和润滑性,较好的改善OA,恢复滑膜和软骨基质的黏弹性,缓解炎症等。本课题研究了LMWH与SH(LMWH-SH)复方凝胶注射液、LMWH注射液及其对OA动物模型的治疗作用和机制。研究中取得了以下几方面的成果。1制备了LMWH-SH、LMWH注射液研究制备了一定浓度的LMWH-SH复方凝胶注射液和LMWH注射液。建立了LMWH-SH复方凝胶注射液的主要质量控制指标,并进行了稳定性考察,表明该复方凝胶注射液具有良好的稳定性。2考察了LMWH-SH、LMWH注射液对OA动物模型的治疗作用建立了木瓜酶诱导的兔膝OA动物模型,以不同浓度的LMWH-SH、LMWH注射液进行兔膝关节腔注射,以生理盐水(normal saline,NS)和SH注射液为对照,给药5周,取关节软骨进行光镜观察,观察关节软骨和滑膜变化情况。结果发现,LMWH-SH各复方制剂均能显著减轻兔膝OA症状。3进行了LMWH-SH复方凝胶注射液的剂量筛选实验根据动物预试实验结果,结合制剂的理化性质,确定LMWH与SH的最佳配比。按照预试动物实验方法,进行剂量筛选实验。4研究了LMWH-SH复方凝胶注射液对OA的作用机制通过碱水解、蛋白酶裂解、超速离心的方法提取分离经LMWH-SH等注射液治疗的OA模型兔膝关节软骨的GAG,用天青A(Azure A,AA)比色法检测GAG总量,用放射免疫法测定其中玻璃酸(hyaluronic acid,HA)的含量,考察治疗后关节软骨基质蛋白聚糖(proteoglycan,PG)的变化。结果发现LMWH-SH复方凝胶注射液能够明显增加病变关节软骨中PG的含量。研究还检测了治疗后OA模型兔膝关节滑液中白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)的表达水平,发现LMWH-SH复方凝胶注射液能够显著降低关节滑液中IL-1β、TNF-α的表达水平。由于IL-6具有双重作用,很难用其表达水平来考察OA的严重程度。综合病理切片、细胞因子(cytokine,CK)水平的考察结果,LMWH-SH复方凝胶注射液的治疗效果较好。根据研究结果推测,复方凝胶注射液组中低LMWH-SH组治疗效果更佳。研究中取得的主要研究成果和结论:(1)研究探讨了LMWH-SH、LMWH注射液的制备工艺和生产条件。(2)研究了质量可控,具有良好稳定性的LMWH-SH复方凝胶注射液。(3)LMWH-SH注射液的流变学性质与文献报道的正常关节滑液的流变学性质类似,因此可以作为人工滑液。(4)考察了不同浓度木瓜酶诱导的兔OA模型的严重程度和适用性。(5)用木瓜酶诱导的兔OA模型考察3种不同配比的LMWH-SH复方凝胶注射液对OA的疗效,研究证实LMWH-SH复方凝胶注射液能够保护关节软骨,显著改善兔膝OA,减轻炎症反应。(6)从免疫分子水平探讨了LMWH-SH复方凝胶注射液对OA的作用机制,发现LMWH-SH复方凝胶注射液可显著降低OA模型兔膝关节滑液中IL-1β和TNF-α的表达水平,从而对软骨PG的降解起到延缓作用,其作用效果较佳。