目的：1、建立腺病毒载体转染人HO-1（heme oxygenase-1，血红素氧合酶—1，热休克蛋白32）基因的技术方法。2、建立获得大量成年SD（Sprague-Dawley，斯普拉-道来）大鼠胰岛及成人胰岛技术方案，为胰岛的体外培养及体内移植实验奠定基础。3、建立以腺病毒为载体转染人HO-1基因至胰岛细胞的方法确定最佳的MOI（multiplicities of infection，感染复数）。4、了解HO-1基因对胰岛细胞的作用，及腺病毒对胰岛细胞形态和功能的影响。并确定人HO-1基因在转染胰岛细胞中的表达情况。5、建立同种异体成年大鼠门静脉内胰岛移植模型。了解HO-1基因对移植胰岛是否具有抗凋亡、延长移植物存活时间、减少淋巴细胞浸润、抑制免疫排斥反应的功能，为基因转染胰岛细胞移植的临床应用奠定基础。方法：1、使用测序仪对质粒载体pobtt进行测序，并和人HO-1基因序列进行比对，通过PCR（polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）对构建好的腺病毒载体Ad-HO-1进行鉴定，鉴定质粒载体和腺病毒载体是否包含人HO-1基因的ORF（open reading frame，开放式阅读框架），对腺病毒载体Ad-HO-1进行扩增、纯化并进行滴度鉴定。2、采用Ricordi等报道的方法，分离纯化成人胰岛。采用胆总管原位插管，胶原酶P液（1mg／ml）灌注，37℃水浴消化、分离大鼠胰岛，Ficoll400（菲科尔400，水溶性聚蔗糖400）间断密度梯度方法纯化胰岛。采用DTZ（Dithizon，双硫棕）染色鉴定胰岛并计算IEQ（islet equivalent，胰岛当量）、AO／PI（acridine orange／Propidium iodide，吖啶橙-碘丙啶）双色荧光染色法测定胰岛活率，胰岛素释放试验鉴定胰岛细胞胰岛素分泌功能。3、使用不同MOI（MOI分别为2、5、10及20）的Ad-EGFP（携带增强型绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体）转染成人及成年大鼠胰岛，通过荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白表达强度和表达时间，将转染EGFP基因的胰岛使用0.05％胰蛋白酶（含0.53mmol EDTA，ethylenediamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸）短暂消化并吹打成单个细胞后使用流式细胞仪检测EGFP表达效率，结合参考文献确定转染胰岛Ad-HO-1的最佳MOI。4、将分离纯化获得的胰岛分为3组：HO-1组（胰岛使用Ad-HO-1进行转染，MOI=20）；EGFP组（胰岛使用Ad-EGFP进行转染，MOI=20）；对照组（不使用任何载体进行转染，其余处理同上述2组）。使用新分离大鼠胰岛作阴性对照，通过Western blot（蛋白质印迹）实验检测基因转染后2d的成人胰岛（HO-1组、EGFP组）及大鼠胰岛（HO-1组、EGFP组）细胞中人HO-1基因的表达情况，进一步鉴定基因载体的正确性、了解转染是否成功。5、EGFP组、HO-1组及对照组成人胰岛体外培养7d后，使用低糖（1.67mmol／L）1640培养液、高糖（16.7mmol／L）1640培养液刺激，收集上清液，使用¹²⁵I人血清胰岛素放射免疫分析药盒检测胰岛素浓度，计算刺激指数。了解几组胰岛的胰岛素分泌功能变化。6、对照组、EGFP组及HO-1组成人胰岛基因转染、体外培养24h后（大鼠胰岛基因转染、体外培养7d后），培养液中加入rTNFa（recombinant tumor necrosis factor-a重组人肿瘤坏死因子a，5000u／ml）及CHX（cycloheximide，放线菌酮，50μg／ml）诱导凋亡。诱导48h后使用0.05％胰蛋白酶（含0.53mmol EDTA）短暂消化，并将胰岛吹打成单个细胞，流式细胞仪检测体外培养胰岛细胞诱导后的凋亡情况。7、腹腔内注射STZ（streptozocin，链脲菌素，65mg／Kg体重）建立SD糖尿病大鼠模型，观察成模后血糖变化情况。将移植受体糖尿病大鼠随机分为3组：对照组（单纯胰岛移植组），接受1200IEQ胰岛，该胰岛不转染任何基因（n=9）；HO-1组，接受1200IEQ胰岛，移植胰岛采用Ad-HO-1转染（n=9）：PBS（phosphate buffered saline，磷酸盐缓冲液）组，大鼠门静脉内仅注射0.8mlPBS（n=6）。观察移植后大鼠的血糖、体重等方面的变化。8、移植后第7d（移植有效时）及移植后第21d（移植物失功），取HO-1组及对照组的肝脏，石蜡包埋后进行连续切片，行HE（hematoxylin／eosin，苏木素／伊红）染色、免疫组织化学染色（胰岛素染色），确定带有胰岛的切片；通过其相邻切片进行免疫组织化学染色观察2组受体肝脏内HO-1蛋白、CD3抗原表达情况，并和HE染色切片进行比较判断淋巴细胞浸润情况并根据相关标准进行分级；使用TUNNEL（terminal deoxynucleotidyl transferase btotin-dUTPnick end labeling，末端脱氧核苷酸转移酶生物素-dUTP切口末端标记法）试剂盒检测移植胰岛细胞的凋亡情况。结果：1、纯化后每只大鼠平均胰岛收获量为629±102IEQ，胰岛纯度大于85％，胰岛细胞活率大于90％。大鼠胰岛细胞体外培养液中胰岛素含量在低糖和高糖刺激下的浓度分别为3.70±0.49 mIU／L和10.48±2.23 mIU／L，刺激指数为2.84±0.10，体外培养1d后开始贴壁，培养1周后几乎完全贴壁，培养1月生长状况仍良好。使用Ad-EGFP转染大鼠胰岛，MOI=2、5、10、20时，EGFP细胞阳性率分别为32.14％±4.94％、40.21％±2.84％、45.30％±2.36％及51.35％±2.91％。2、测序结果显示质粒载体pobtt含有人HO-1基因的ORF；腺病毒载体PCR结果显示该载体含有人HO-1基因的基因序列；绿色荧光蛋白在成人胰岛及大鼠胰岛细胞中的表达能够持续4周以上，表达强度以转染后第7d为最强。3、转染HO-1基因的成人胰岛在高糖刺激下胰岛素分泌量明显升高270.09±89.37 mIU／L，和对照组182.36±58.96 mIU／L及转染EGFP基因的胰岛175.95±75.05 mIU／L相比，具有显著性差异（P＜0.05）；使用rTNFa及CHX诱导，成人胰岛HO-1组胰岛细胞凋亡发生率为63.08％±10.86％，明显低于对照组的90.86％±11.25％（P＜0.01）；大鼠胰岛HO-1组诱导后凋亡细胞的发生率为4.22％±2.38％，显著低于EGFP组的28.76％±14.76％及对照组的23.81％±8.51％（P＜0.05）；EGFP组的胰岛凋亡率虽然高于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。4、STZ诱导的大鼠糖尿病模型稳定，观察2个月维持高血糖状态，并具有糖尿病的“三多一少”典型症状。5、糖尿病大鼠移植当天血糖水平分别为：对照组，23.67±2.57 mmol／L；HO-1组，22.05±2.57 mmol／L；PBS组，24.06±3.57 mmol／L；组间血糖水平差异无显著性（P＞0.05）。移植后，HO-1组移植物存活时间为10.56±4.33 d，显著长于对照组移植物存活时间的5.33±4.18d（P＜0.05），PBS组血糖未见明显降低。移植3周时，HO-1组糖尿病大鼠体重增加明显。移植3周时HO-1组的体重增加指数为19.82％±12.4％，显著高于对照组的0.66％±6.24％及PBS的0.25％±9.16％（P＜0.05）。6、使用Ad-HO-1转染的胰岛移植后第7天仍可见HO-1蛋白明显表达。移植后第7天转染HO-1基因的胰岛内淋巴细胞浸润程度为0～1级，单纯胰岛移植组淋巴细胞浸润程度为2～3级。单纯胰岛移植组移植到肝脏内后胰岛细胞凋亡发生率为4.2％±2.3％，转染HO-1基因胰岛移植组胰岛细胞未见明显凋亡。移植3周后2组大鼠肝内移植胰岛无胰岛素表达，淋巴细胞浸润程度为3级。结论：1、采用胶原酶P消化、Ficoll400非连续密度梯度离心法可获得高纯度、高活率的大鼠胰岛。2、携带人HO-1基因的腺病毒载体构建成功，能在体外培养的胰岛细胞中表达。3、腺病毒载体对成人胰岛及大鼠胰岛具有较高的转染效率，在胰岛细胞内表达时间较长。4、使用携带人HO-1基因腺病毒载体（Ad-HO-1）转染体外培养的胰岛细胞能够增加胰岛细胞的抗凋亡能力，HO-1基因能够促进成人胰岛细胞胰岛素的分泌。5、HO-1基因能够明显延长肝内移植胰岛的存活时间，减少移植物的凋亡。6、HO-1基因转染移植胰岛能够明显减轻淋巴细胞对移植胰岛的浸润、减轻免疫排斥反应。7、使用腺病毒载体转染HO-1基因胰岛移植具有潜在的临床应用价值。