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研究背景神经干细胞(NSCs)的发现为许多伴有神经元丢失的神经系统疾病提供新的治疗途径。然而,NSCs来源是目前研究面临的一大难题。现对外源性神经干细胞来源的研究主要关注体细胞诱导的NSCs,因其诱导周期短,且不经过多能干细胞阶段致瘤性低,是目前安全高效的神经干细胞来源。其中用小分子化合物(SM)对特定细胞通路的抑制或激活,使体细胞诱导为神经干细胞,安全性高,是目前最具研究前景的神经干细胞来源。本研究通过文献阅读和前期预实验,筛选出7种小分子化合物,但发现其共同作用会引起细胞大量死亡。故结合体细胞重编程为NSCs的规律和SM作用通路的特点,以及预实验结果,我们在不同阶段采用不同的SM,以减少每阶段SM的使用和提高诱导效率获得阶段小分子化合物诱导的神经干细胞(SMSINS)。此外,在诱导方案探索阶段,我们发现丙戊酸(VPA),作为诱导方案中其中一种小分子化合物,其在增强NSCs诱导效率和神经元分化方面显示出最显著的作用,可能与VPA对mTOR信号通路的激活有关。因此,我们提出研究假设:VPA明显提高诱导神经干细胞(iNSCs)诱导效率,使iNSCs能更好向神经元分化,可能与mTOR信号的激活有关。研究目的1.探讨小分子化合物的诱导方案,得到一种无外源基因导入、效率更高的神经干细胞。2.探讨VPA调控mTOR信号对诱导神经干细胞的作用和机制。研究方法提取原代小鼠胚胎成纤维细胞,阶段加入SM诱导:第1-2天LDN193189,SB431542;第 3-4 天 CHIR99021,DAPT,VPA;第 5-6 天 CHIR99021,DAPT;第7-8天Shh,Purmorphamine;第9-10天去除所有小分子化合物的NSC培养基。之后,采用免疫荧光法和流氏细胞学法检测神经干细胞特异性蛋白表达,并鉴定神经干细胞分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。细胞分组:SMSINS,-VPA,SMSINS+雷帕霉素和-VPA+MHY1485。采用CCK8法、Western blot、免疫荧光法分别检测增殖能力、mTOR表达水平、NSCs特异蛋白和神经元特异蛋白的表达。研究结果1.小分子化合物阶段诱导iNSCs高表达NSCs特异蛋白Nestin和Sox2,并且有传代增殖能力,体外自主分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力,以及诱导分化为多巴胺能、胆碱能和GABA能神经元的能力。对每种SM诱导iNSCs效率检测,示VPA作用效果最显著,其次是DAPT,LDN193189,Purmorphamine/Shh,CHIR99021 和 SB431542。2.VPA激活mTOR信号。抑制mTOR信号通路使诱导效率降低,减少神经元分化,激活mTOR通路可以部分提高诱导效率和神经元分化。结论1.通过小分子化合物阶段诱导法可将小鼠胚胎成纤维细胞诱导为神经干细胞。2.VPA提高小鼠胚胎成纤维细胞诱导为神经干细胞的重编程效率和神经元分化与mTOR信号通路激活有关。