手性醇是一类重要的手性模块化合物,广泛应用于医药、化工和农业等领域。利用高立体选择性氧化还原酶或其全细胞不对称还原潜手性羰基化合物是制备光学活性手性醇的有效途径。羰基还原酶是一类以NAD(P)H为辅酶、在酶学分类上属于短链脱氢酶/还原酶类的氧化还原酶,因其具有高化学选择性、高区域选择性和立体选择性,被认为是一类极具潜力的用于不对称催化还原反应的生物催化剂。开发新型、高效的羰基还原酶对丰富微生物还原酶库,探索酶的分子催化机理及其工业应用具有重要的理论价值和实践意义。(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇((R)-BTPE)是合成用于治疗癌症病人化疗时引起恶心和呕吐的NK-1受体拮抗剂(如阿瑞吡坦和福沙吡坦)的重要手性中间体。不对称生物还原3,5-双三氟甲基苯乙酮(BTAP)是制备(R)-BTPE的重要方法。本论文以雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904源羰基还原酶(LXCAR)为研究对象,以不对称还原BTAP制备(R)-BTPE为模型反应,通过酶的分离纯化、基因克隆、定向进化和分子模拟等方法对LXCAR的酶学性质、催化功能、结构与功能之间的关系等关键问题进行研究。研究结果为生物催化制备功能手性化合物提供新酶源和新途径,为深入认识LXCAR的催化功能和分子催化机理奠定重要的基础。首先,对L.xyli HS0904源羰基还原酶进行分离纯化和酶学性质表征。采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-sepharose FF弱阴离子交换层析、octyl-sepharose 4 FF疏水层析、High Q强阴离子交换层析和SuperdexTM 200凝胶层析等方法对L.xyli HS0904源羰基还原酶进行分离纯化,获得电泳纯LXCAR。对LXCAR的分子量、亚基数目和N端氨基酸序列进行分析,并对其酶学性质进行表征。结果表明,LXCAR是由分子量约为24 kDa的亚基组成的同源二聚体,其分子量约为49 kDa;酶的N端氨基酸序列为AQYDVAGRSAI;该酶的最适反应pH值和温度分别为7.2和34℃,且其在4℃保存24 h后的残余酶活力仍保持有90%以上;Mg2+、Mn2+、Ca2+、Co2+、L-半胱氨酸、L-谷胱甘肽、尿素、聚乙二醇-1000和聚乙二醇-4000等对酶活性有促进作用,Fe2+、Pb2+、Sn2+、Fe3+、EDTA、异丙醇、二甲基甲酰胺、四氢呋喃和正己烷等对酶活性有抑制作用;该酶对底物BTAP和辅酶NADH的动力学参数Vmax和Km值分别为 33.9 U/mg、0.383 mM 和 69.9 U/mg、0.412 mM;该酶有广泛的底物谱,对多种烷基酮、芳香酮和酮酯等均有还原活性。随后,对LXCAR进行基因克隆和定向进化,并运用分子模拟的方法探索其分子催化机理。以LXCAR的N端氨基酸序列、飞行质谱分析和同源序列比对结果等为依据设计一系列简并引物,成功从L.xyli HS0904的基因组中克隆出LXCAR的编码基因,并实现其在E.coli BL21(DE3)中的高效表达;测得重组大肠杆菌粗酶液的酶比活力为1.54 U/mg,是野生菌L.xyli HS0904粗酶液的酶比活力(0.0249 U/mg)的62倍。对LXCAR氨基酸序列进行生物信息学分析表明,LXCAR与来源于L.sp.S749的短链脱氢酶(LSADH)具有89%的序列相似性,且含有属于短链脱氢酶典型特征的两个非常保守序列,即N端辅酶结合域(TGX3GXG)和催化活性域(NX27SX12YX3K)。进一步验证LXCAR是由分子量约为24 kDa的亚基组成的同源二聚体,且不同于文献报道的L.sp.S749源LSADH(LSADH是同源四聚体),因此,LXCAR属于短链脱氢酶家族的新成员。采用易错PCR、定点突变和定点饱和突变等技术对LXCAR进行定向进化,获得具有高还原活性的突变子LXCAR-S154Y(154位丝氨酸突变为酪氨酸)。对突变酶LXCAR-S154Y进行分离纯化和酶学性质表征,结果表明,突变酶LXCAR-S154Y的比活力、动力学参数kcat和kcat/Km值分别是重组酶LXCAR的2.3倍、5.4倍和12.6倍。以PDB数据库中与LXCAR-S154Y氨基酸序列具有最高相似性的Sinorhizobium meliloti 1021源短链脱氢酶和Thermus thermophilus HB8源氧化还原酶的三维结构为模板,基于Discovery Studio 3.0软件对LXCAR-S154Y的三维结构进行预测,预测的LXCAR-S154Y三维结构经拉氏图分析表明是可信的。基于Discovery Studio 3.0软件中Flexible Docking模块,将底物BTAP对接到预测的酶三维结构中,获得底物BTAP与酶结合的复合物。对底物与酶结合的复合物进行分析,探索酶与底物结合的相互关系以及不对称还原的分子催化机理。结果表明,底物BTAP的羰基氧与酶活性部位氨基酸残基Ser144和Tyr157形成氢键,且羰基氧与Tyr157非常接近,可能是因为Tyr157-OH作为氢的供体可使底物的羰基氧质子化,以有利于NADH烟酰胺环C4原子上的氢攻击底物的羰基氧,使底物的羰基氧发生羟基化;活性部位的氨基酸残基Lys161与辅酶烟酰胺环相连的核糖环上的O2’形成氢键,可能是因为Lys161可作为氢供体,将一个氢原子传递给O2’,然后氢原子再从O2’传递给Tyr157,使Tyr157-OH再生,有利于Tyr157-OH的循环;活性部位的氨基酸残基Asn1 16与Lys161邻近,可能是因为Asn1 16作为一个氢的传递者,能从溶剂中获得氢,再将氢传递给邻近的Lys161,使Lys161上的氢再生。基于对突变前后酶与底物复合物结构的分析表明,突变后酶-底物复合物的结合自由能由突变前的-10.3 kcal/mol 下降为-79.3 kcal/mol,且突变后底物上的羰基氧与辅酶NADH酰胺环上的氢之间的距离由突变前的3.994 A缩短为3.783 A。这些结果表明,突变后酶-底物复合物更加稳定,且因酪氨酸比丝氨酸空间结构大,使得在形成复合物时促使底物向辅酶的酰胺环靠近,有利于酰胺环C4上的氢传递给底物的羰基氧,使其更容易发生羟基化。最后,研究重组工程菌的葡萄糖流加培养过程,重组菌在缓冲体系和基于含离子液体的缓冲体系中不对称还原BTAP制备(R)-BTPE的工艺。结果表明,重组工程菌流加葡萄糖培养过程时获得最大的菌体量和比活力分别为32.4 g/L(DCW)和308.5μmol/min/gcell;重组菌在缓冲体系中不对称还原BTAP制备(R)-BTPE的最佳工艺为:辅助底物异丙醇浓度、反应温度、pH值、底物浓度和菌体浓度分别为20%(v/v)、30℃、7.2、1000 mM和12.7 g/L(DCW)。成功构建含新型离子液体[N1,1,1,1][Cys]的磷酸缓冲体系用于重组菌不对称还原BTAP制备(R)-BTPE,优化得到的离子液体[N1,1,1,1][Cys]的含量、最适反应温度、最适磷酸缓冲液pH值、最适底物浓度和最适菌体量分别为3.5%(w/v)、30℃、6.8、1000 mM 和 12.7 g/L(DCW);在此最优条件下,重组大肠杆菌在12 h内可将1000 mM BTAP不对称还原为(R)-BTPE,产率为98.7%,ee值大于99%。这是目前关于生物法不对称还原BTAP制备(R)-BTPE最高的催化底物量和最高的产物(R)-BTPE得率。在上述最佳条件下,在5.0 L发酵罐中进行不对称还原BTAP制备(R)-BTPE的研究,结果表明,在缓冲体系和基于离子液体的缓冲体系中,反应12 h,产率分别为80.9%和93.9%,ee值均在99%以上。反应液经正己烷萃取、真空蒸馏和硅胶柱层析等方法进行分离纯化,还原产物纯度达99%以上,通过1H、13CNMR、旋光度测定和与标准品比较分析,确证产物为(R)-BTPE。