甘蓝型油菜（Brassica napus L.）是继大豆之后的第二大油料作物。它是十字花科的四倍体物种（AACC,2n=4x=38）,是由白菜（B.rapa;AA,2n=20）和甘蓝（B.oleracea;CC,2n=18）间的自然杂交进化而来。EOD3基因编码一种细胞色素氧化酶P450单加氧酶蛋白,参与种子的生长调控。种子大小是影响作物产量的重要农艺性状。通常,小粒种子可以增加种子数量而有利于后代繁殖。但是,目前油菜中的种子大小调控机制还知之甚少。CRISPR/Cas9目前已经广泛应用于不同作物的产量、品质和抗性等性状的遗传改良种子的大小和数量对于植物的进化适应性至关重要,对于作物的种子生产也至关重要。在这里,我们报告油菜籽中EOD3/CYP78A6基因的基因克隆,表达分析和功能表征。在本研究中,我们针对油菜中BnaEOD3基因的四个同源拷贝（BnaA04.EOD3,BnaA05.EOD3,Bna C04EOD3a and Bna C04.EOD3b）开展功能研究,在种子发育过程中表现出稳定的高表达,各拷贝之间存在差异表达。目前,油菜中还没有该基因的自然或诱导突变体,主要是因为它的异源四倍体基因组中具有多个同源拷贝所致。因此,我们利用CRISPR/Cas9技术创建了BnaEOD3基因突变体,并通过PCR和Hi-TOM技术进行了编辑检测。从T₀到T₂代可以检测到该基因高达83%-90%的突变频率。这些突变稳定地传递给T₁和T₂世代,并创建了一大批纯合突变体,这些突变体具有跨越四个BnaEOD3拷贝的联合功能缺失等位基因,用于表型分析。表型分析发现该基因的纯合突变体表现出角果长度、籽粒大小和粒重的减少、每角果而每株粒数和每角果粒重的显著增加。尤其是四拷贝纯合突变体变化最为显著。因此,与野生型（WT）相比,第四纪突变体中每株植物的种子重量平均增加了13.9%,表明这些BnaEOD3拷贝在种子发育中具有多余的功能,BnaEOD3拷贝的不同等位基因组合的表型也揭示了两个亚基因组之间的基因功能差异。其中,Bna C04EOD3a和BnaA05.EOD3较其它两个拷贝发挥的功能更大。细胞学观察发现BnaEOD3基因突变体的胚细胞数量减少和细胞变小导致胚变小。纯合突变体的细胞数量仅有野生型的0.9左右。总的来说,我们的发现揭示了不同BnaEOD3复制功能在种子发育中的定量参与,但也为油菜育种计划提供了宝贵的资源。我们利用CRISPR-P工具在甘蓝型油菜基因组中共鉴定到四个靶点的47个潜在脱靶位点。对T₀代单株进行分析未检测到脱靶效应的产生。因此,在油菜中通过设计特异的靶点可以控制脱靶效应的产生。通过不同靶点编辑效率的比较分析发现,四个靶点的编辑效率变异很大:S1和S4的效率很高,分别达到44.90%和45.60%;其次是S3（20.00%）;而S2未检测到突变。它们的编辑效率的高低与它们各自的启动子有关。其中,At U3d和At U6-29启动子可能更有利于sg RNA的表达,导致其在油菜中的编辑效率较高。我们也通过定量PCR检测了BnaEOD3基因在不同组织和发育时期的表达特异性。四个同源拷贝都在7 DAF种子14 DAF角果具有较高的表达量。其中,Bna C04.EOD3a和BnaA05.EOD3的基因表达量较其他两个拷贝更高;我们进一步检测了各个同源拷贝在开花后7、14、21、28和35 DAF等种子不同发育时期的表达情况。结果表明四个拷贝的基因表达量都是从7 DAF开始持续升高,21 DAF到达最高点,然后28 DAF和35 DAF持续降低。因此,我们认为BnaEOD3的四个拷贝可能均参与种子发育的调控。综上所述,本研究所创建的BnaEOD3突变体可以产生小而多的种子,最终可能导致油菜产量的增加。因此,本研究为揭示BnaEOD3基因的功能以及油菜的产量育种提供了优异的种质资源。