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实验背景:食管癌(Esophageal cancer,EC)是指发生在食管上皮的恶性消化道肿瘤,其中最常见的病理类型是食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(Esophageal adenocarcinoma,EAC)。最新的研究数据表明,在全球癌症患者中,EC新发病率和死亡率分别位居第7位和第6位。中国是食管癌高发区之一,发病患者中95%以上被确诊为ESCC。由于ESCC存在着确诊时间较晚、易发生转移和预后易复发,尽管使用手术切除或同步放化疗等多种治疗方法,但ESCC患者的5年总生存率仍低于20%,且患者生存质量未得到明显提高。因此,迫切需要从ESCC发生、发展过程中寻找新的治疗方法来提高ESCC患者的预后生存率。AZD1775是一种已进入临床试验,且可口服的小分子吡唑类化合物,该化合物可以高度特异性地抑制Wee1激酶活性。Wee1是参与细胞周期检查点的重要激酶之一,尤其对G2/M期发挥着重要作用。AZD1775通过抑制Wee1激酶活性而抑制CDK1的酪氨酸15位点磷酸化,进而抑制肿瘤细胞内损伤DNA的修复。研究表明AZD1775对乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、神经胶质瘤、肝癌等癌症中具有较好地抗肿瘤作用。但是,到目前为止,关于AZD1775对ESCC的作用未见报道。实验目的:本课题以ESCC细胞为实验研究对象,探讨Wee1选择性抑制剂AZD1775在体外和体内对ESCC细胞的作用及其分子机制研究。实验方法:采用免疫组化法检测Wee1在ESCC临床肿瘤组织中的表达情况,采用Western blotting和q RT-PCR法检测Wee1在ESCC细胞中的表达。Western blotting和免疫荧光检测AZD1775对ESCC细胞(KYSE150、EC109)中p-CDK1Y15、p-HH3S10、γH2A.X蛋白表达的影响;PI单染检测AZD1775对ESCC细胞周期分布情况的影响;MTT法检测AZD1775对ESCC细胞在体外增殖的影响,以及结合Chou-Talalay联合指数计算法检测AZD1775与5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)或顺铂(Cisplatin,CDDP)联用是否对ESCC细胞生长具有协同作用;平板克隆及软琼脂克隆检测AZD1775对ESCC细胞克隆形成的作用;Annexin V-FITC/PI双染检测AZD1775对ESCC细胞发生凋亡的影响;Western blotting检测AZD1775对ESCC细胞中Bcl-2、Bax、Bcl-XL、XIAP、Survivin、PARP、Caspase-3、Cytochrome c、AIF蛋白表达的影响;Rh123/Hoechst 33342双染检测AZD1775对ESCC细胞内线粒体膜电位变化的影响;Wound healing及Transwell实验检测AZD1775对ESCC细胞迁移和侵袭的作用;Western blotting检测AZD1775对ESCC细胞中蛋白MMP-2和MMP-9表达的影响。使用慢病毒表达sh RNA敲低ESCC细胞中Wee1,并检测对ESCC细胞的增殖、克隆形成、迁移及侵袭的影响;Western blotting检测Wee1 sh RNA对ESCC细胞中p-CDK1Y15、p-HH3S10、γH2A.X、MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响。建立KYSE150细胞的裸鼠皮下实体瘤模型,检测AZD1775是否抑制ESCC细胞在裸鼠体内生长;免疫组化检测AZD1775对裸鼠肿瘤组织中增殖相关蛋白Ki67、Wee1相关蛋白p-CDK1Y15、DNA修复相关蛋白p-HH3S10、DNA损伤相关蛋白γH2A.X表达的影响;H&E染色检测裸鼠肿瘤组织中ESCC细胞的形态变化;Western blotting检测AZD1775对裸鼠肿瘤组织中Wee1、p-CDK1Y15、p-HH3S10、γH2A.X蛋白表达的影响。建立KYSE150细胞的裸鼠肺转移模型,检测AZD1775对ESCC细胞在裸鼠体内发生肺转移的影响。实验结果:1.免疫组化检测得出Wee1在ESCC细胞系和临床肿瘤标本中存在高表达。2.使用不同浓度的AZD1775作用ESCC细胞(KYSE150和EC109)72 h,MTT法检测发现,AZD1775对KYSE150和EC109均有显著地抑制作用,IC50分别为0.55μM、0.58μM;此外,平板克隆和软琼脂克隆形成实验结果表明,随着AZD1775药物浓度增大,可明显抑制ESCC细胞形成。3.Annexin V-FITC/PI双染检测结合流式细胞仪检测结果发现,AZD1775呈浓度和时间依赖性诱导ESCC细胞发生凋亡;Western blotting检测显示,AZD1775呈浓度依赖促进Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3、及促凋亡蛋白的表达,降低Caspase-3、及抗凋亡蛋白XIAP、Survivin、Bcl-XL、Bcl-2的表达。4.Rh123/Hoechst33342双染结合高内涵检测发现,随着AZD1775浓度逐渐增大,ESCC细胞的线粒体膜电位逐渐降低;此外,Western blotting检测胞浆蛋白提取物发现,AZD1775呈时间依赖性诱导cytochrome c和AIF从线粒体释放到细胞浆中。5.Wound healing和Transwell迁移实验检测发现,250 n M的AZD1775可明显抑制KYSE150和EC109细胞迁移;此外,Transwell迁移实验检测表明,250 n M的AZD1775显著抑制KYSE150和EC109细胞侵袭而且,Western blotting检测显示,AZD1775呈浓度依赖性抑制MMP-2、MMP-9蛋白表达。6.纳摩尔浓度的AZD1775对两种ESCC细胞(KYSE150和EC109)中Wee1激酶均有较强的抑制作用;明显抑制p-CDK1Y15蛋白表达,而促进p-HH3S10、γH2A.X蛋白表达;此外,AZD1775可显著抑制ESCC细胞G2/M期阻滞作用。7.使用慢病毒表达sh RNA敲低Wee1能显著抑制ESCC细胞的增殖、迁移、侵袭,以及MMP-2、MMP-9蛋白表达。8.敲低Wee1明显抑制ESCC细胞中p-CDK1Y15蛋白表达,而促进p-HH3S10、γH2A.X蛋白表达。9.MTT法结合Chou-Talalay联合指数计算法检测发现,AZD1775与5-FU、CDDP联用,具有较好的协同抑制ESCC细胞的增殖作用;此外,台盼蓝染色计数法检测显示,与单药AZD1775、5-FU或CDDP组相比较,AZD1775(0.25μM)与5-FU(250μM)或CDDP(10μM)联用显著地增加了ESCC细胞死亡比例;而且,Western blotting检测结果显示,ZD1775(0.25μM)与5-FU(250μM)或CDDP(10μM)联用明显促进Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3蛋白表达。10.KYSE150细胞裸鼠皮下移植瘤模型检测结果发现,60 mg/kg的AZD1775能明显抑制ESCC细胞在裸鼠体内的生长;免疫组化检测结果显示,与对照组相比,AZD1775能显著降低肿瘤组织中p-CDK1Y15、以及细胞增殖相关蛋白Ki67的表达,而促进p-HH3S10、γH2A.X蛋白表达。11.Western blotting检测结果表明,与对照组相比较,AZD1775显著抑制裸鼠肿瘤组织中的p-CDK1Y15蛋白表达,p-HH3S10、γH2A.X蛋白表达显著增加。12.KYSE150细胞裸鼠肺转移模型检测结果发现,与对照组相比较,60 mg/kg的AZD1775能显著抑制ESCC细胞在裸鼠体内发生肺转移。实验结论:综上所述,实验结果表明Wee1在ESCC中高表达。Wee1选择性抑制剂AZD1775可有效地抑制ESCC细胞在体外的增殖、迁移和侵袭,并能有效地抑制在体内的生长及转移。此外,AZD1775可显著地增强ESCC细胞对一线化疗药5-FU及CDDP的敏感性。基于以上研究,AZD1775可能是治疗ESCC的潜在靶点药物,值得进一步临床试验。