背景:下腰痛(low back pain，LBP)是临床常见疾病，是导致劳动力丧失的主要原因之一，现在一致认为椎间盘退变性疾病(Degenerative disc disease，DDD)是引起LBP最常见的原因。有报道发现80%的人一生当中都曾发生过LBP，如此高的发病率给国家和社会带来了严重的经济损失。目前治疗DDD的方法包括保守治疗和手术治疗。保守治疗属对症治疗，以减轻和缓解疼痛为目的，不能解决椎间盘(Intervertebral disc, IVD)退变导致的生物学丧失问题，因此并不能从根本上解决疼痛的根源。手术治疗主要包括髓核摘除术和脊柱融合术。手术治疗旨在解除突出的椎间盘组织的机械压迫作用，从而达到解除疼痛的目的，但其也因未能恢复IVD的生物学性能，远期效果并不好，且常因内固定的使用而加速相邻节段椎间盘退变，从而发生新的问题。随着科学技术的日新月异，特别是近年来逐渐出现了多种IVD移植和人工椎间盘置换技术，这些技术一定程序上改善了临床治疗的效果，但这些技术也没有从根本上解决或者逆转IVD的生物学功能，仍然存在许多并发症和缺陷。现在认为理想的治疗DDD的方法是既能缓解疼痛症状，又能恢复IVD的结构和生理功能，远期效果好，复发率低。随着基础医学特别是干细胞研究的迅速发展，基于干细胞的治疗手段已成为治疗DDD最有希望前途的手段之一。近年来，应用组织工程技术对退变椎间盘进行再生和修复的研究取得了一些成绩，寻求以提高所构建的组织工程椎间盘的生物学活性为目的的新型种子细胞来源成为一项重要的任务。当前，多项研究证实人退变纤维环、髓核组织中存在具有多向分化潜能的干细胞。此外，在我们的前期工作中，课题组从人退变软骨终板中亦分离出类似于MSC的干细胞，这些细胞经诱导可以向骨、软骨、脂、肌方向分化，且体外实验结果显示出比BM-MSCs更强的成软骨能力。本研究旨在前期研究的基础上，从人退变椎间盘中分离、扩增纤维环细胞、髓核细胞、软骨终板细胞，经琼脂糖悬浮培养法筛选后，并探讨纤维连接蛋白筛选的效能，所获取的干细胞克隆与来自同一个体的BM-MSCs进行初步的细胞生物学特性比较，作为种子细胞分别构建组织工程髓核，进一步比较上述四种干细胞在动物体内的髓核再生和椎间盘的修复能力。目的：通过体内、外实验对NPSCs、AFSCs、CESCs与BM-MSCs的生物学特性进行检测与比较，初步探讨四种干细胞在细胞形态、增殖活性、表面标记物和体外向三系分化的能力以及作为组织工程种子细胞在组织工程应用上的生物学特性差异，以期寻找一种新的、可应用于组织工程学的种子细胞,为组织工程椎间盘的构建甚至临床的应用治疗提供良好的种子细胞来源。方法：从因患腰椎间盘退变性疾病行椎间盘摘除植骨融合术中收集符合纳入标准的标本。将手术中最先切除出来的AF组织经副教授以上职称经验丰富的术者确认后，收入AF标本盒，随后两次切除组织予以舍弃，其后切除的标本经术者确认为NP时装NP标本盒，刮除的CEP装入CEP盒，植骨前取髂骨时接>5ml骨髓，以上标本再在解剖显微镜下清理异物杂质如韧带、肌肉及脂肪等，再次分离AF、NP及CEP，运用机械-酶消化法获取AF细胞、NP细胞和CEP细胞。BM-MSCs运用Percoll液梯度分离法获取。获得的IVD来源的三种细胞经体外扩增至第2代时，第2代细胞经琼脂糖悬浮培养法筛选，并初步探讨Fibonectin差别粘附法的筛选效果，挑选取单细胞形成的克隆进行体外扩增，扩增后的细胞进行流式细胞术检测干细胞标志物、多向分化能力，进行干细胞的鉴定。同样，经诱导向骨、软骨及脂三系分化的不同干细胞，经RT-PCR及组织学检测分析，寻找不同干细胞向不同细胞系分化能力的差异性。将不同干细胞复合藻酸盐体外构建组织工程髓核，培养1、7、14及28天后进行支架细胞增殖检测、DNA和sGAG含量检测，最后行SEM检测，寻找差异性。另外所获细胞经CFDA-SE荧光染料标记后植入纤维环穿刺抽髓核抽吸法制造的椎间盘退变动物模型体内，于术后第1、3及6月后进行MRI和X线检测评估IVD的退变情况，并在第6月处死动物，进行目标椎间盘的组织学检测评估。鉴于在前两部分实验中，发现四种不同干细胞中，CESCs具有最强的体外成骨及成软骨能力，复合藻酸盐构建的组织工程髓核也具有良好的生物学性能。此外,已有大量研究发现BM-MSCs具有良好的体内成骨效应，常常作为种子细胞来探讨用于横突间植骨融合的应用研究，并显示出了良好的应用前景。因此，我们特将CESCs与BM-MSCs一起复合多孔羟基磷灰石植入新西兰大白兔两侧横突间，术后2月时间内进行X线、三维CT及micro CT检测及组织学评估，探讨两种不同干细胞间的成骨效应差异，分析和评估横突间融合的融合效率差异。数据应用SPSS13.0软件作统计学处理，定量结果采用配对T检验、单因素方差分析和重复测量的单因素方差分析进行统计分析，P<0.05被认为具有统计学意义。结果：1．来自同一个体的AFSCs、NPSCs、CESCs与BM-MSCs形态上类似，呈成纤维细胞样外观，但仍存在细小差别，AFSCs最细长，BM-MSCs最宽大，而CESCs尺寸最短，NP居中；四种干/祖的体外增殖能力没有显著差异；在体外实验观察中，经PCR及半定量分析，CESCs成骨和成软骨能力最强，AFSCs和BM-MSCs居中，两者没有显著差异，而NPSCs最弱；BM-MSCs成脂能力最强，NPSCs次之，CESCs和AFSCs最弱；流式细胞术结果表明，AFSCs和CESCs的CD105表面标志物均值呈中强表达，低于95%，而NPSCs略低于95%，四组干细胞的其它标志物的表达，满足ISCT对间充质干细胞的定义标准；四种干细胞体外构建的组织工程髓核培养结果表明，CESCs与BM-MSCs组中合成和分泌的sGAG与DNA含量最高，NPSCs次之，AFSCs最弱；组织工程髓核中的细胞增殖无显著差异；组织工程髓核的SEM结果表明，各干细胞皆与支架粘附较好，在28天后能分泌大量的ECM，其中CESCs最多，BM-MSCs次之，NPSCs居中，AFSCs最弱。2．AFSCs、NPSCs、CESCs与BM-MSCs复合藻酸盐植入椎间盘退变的动物模型体内，通过术后的检测分析，CESCs-藻酸盐复合物相对其余三组细胞具有最强的髓核再生和椎间盘修复能力，BM-MSCs-藻酸盐和NPSCs-藻酸盐居中，而AFSCs-藻酸盐最弱。3．CESCs与BM-MSCs与HA复合进行兔腰椎横突间植骨对比中，两组干细胞复合HA皆能达到横突融合，增强脊柱的稳定性；CESCs相对BM-MSCs具有更强的体内成骨能力；多孔羟基磷灰石在应用于腰椎横突间植骨融合实验时，抗折性较差，需要加以改进，以适应一定的抗折性要求。结论：1.体外比较实验中，CESCs具有最强的成骨和成软骨能力，AF和BM-MSCs居中，NPSC最弱。2．CESCs显示了用于构建组织工程髓核的优秀的生物学特性，在体内或体外都可以作为一种具有优越性能的种子细胞应用于髓核组织工程领域，发挥干细胞的潜能。3．初步实验结果表明相比较BM-MSCs，CESCs具有更强的体内成骨能力。此外，CESCs能够作为一种优秀的种子细胞用于腰椎横突间融合，通过提高融合率和增强成骨效应，达到增加脊柱稳定性的作用。