1.研究背景和目的慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)是发病率和死亡率较高的严重的公共健康问题,其治疗仍是临床的一大挑战。据流行病学和全国登记资料统计,我国慢性肾病的人群发病率平均水平为10%。目前每年用于透析治疗的费用已超过96亿元。慢性肾功能衰竭(chronic renal failure,CRF)是常见的临床综合征,发生在各种慢性肾脏疾病基础上,缓慢地出现肾功能减退并最终导致肾衰竭。肾脏纤维化是CRF主要病理特征,它是各种慢性肾脏疾病的最终归宿和必然结局,纤维化病变迄今无法阻抑或逆转。细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)合成和降解失衡,造成大量积聚是引起肾间质纤维化的主要原因。而氧化应激也存在于各种肾脏疾病的始末,它是慢性肾脏疾病多种病理损伤的共同通路。肾脏中很多细胞都可以产生氧自由基,包括肾小球系膜细胞、肾间质细胞、肾小管上皮细胞等,都可以成为氧自由基的来源。而氧自由基可刺激这些细胞,分泌多种炎症因子和粘附分子的表达,如纤连蛋白(FN)、细胞间粘附分子(ICAM-1)、单核细胞趋化因子(MCP-1)等。这些趋化因子能促进ECM在胞外的沉积,同时又能抑制其降解,而最终导致肾脏纤维化。由于慢性炎症和氧化应激与CKD的发展密切相关,新的抗炎抗氧化应激的途径引起研究者的强烈兴趣。Nrf-2激活剂:Bardoxolone methyl能修复炎症部位的氧化还原动态平衡,但是III期临床试验却因其严重的副作用而停止。PPAR-α受体激活剂:十六酰胺乙醇(PEA)能抑制炎症,稳定肥大细胞,其作用还有待研究。通过肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)阻滞剂延缓CRF的进展已经有了强有力的证据,但时常也不起作用。其他的一些治疗方法如:内皮素受体拮抗剂,氨基葡聚糖,晚期糖基化终产物抑制剂,红细胞生成刺激因子,HMG-CoA还原酶抑制剂等治疗也不尽人意。因此加强CRF的早期防治,降低终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)的发病率具有十分重要的意义。中医对于CKD的认识上,包含两个方面:本虚证(脾肾气虚、气阴两虚、肝肾阴虚、脾肾阳虚、阴阳两虚)标实证(湿浊、湿热、血瘀、水气、浊毒)。对其发病及病症本身的认识仍没有使人信服的观点。在治疗上一般从以下几个方面改善CKD的临床症状:改善微炎症状态,使用复方丹参片,黄芪注射液等可以改善CKD患者普遍存在的慢性微炎症状态。改善氮质血症,部分中药中的鞣质成分尤其是大黄中大黄鞣质,可减少肠道对合成尿素的原料氨基酸的吸收,升高血中必需氨基酸的浓度,并利用氨合成蛋白质,使肝、肾组织合成尿素减少,抑制体内蛋白质分解,还促进尿从肾脏排出。提高免疫功能,金水宝胶囊(冬虫夏草菌丝)等。抑制肾小球硬化和间质纤维化,如丹参注射液、川芎嗪注射液、灯盏花注射液、疏血通注射液等。目前上市的用于治疗慢性肾衰的中成药主要有尿毒清颗粒,肾衰宁胶囊,康肾注射液等疗效也不尽人意。尿毒清颗粒由我院研发,在原研中的实验表明,尿毒清颗粒对中医辩证属脾肾气虚湿浊证及脾肾气虚血瘀证的CRF显效率为20.67%,总有效率为69.33%。该药不仅在疗效方面有提高的空间,而且其作用机理也有待进一步探讨,为寻求更加高效的治疗药物提供实验数据。本课题组在尿毒清颗粒的基础上对原方进行了组方研究,以腺嘌呤灌胃法制备的CRF大鼠模型中,证明其能显著降低血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)及降低CRF大鼠体内的氧化应激反应。本课题研究拟采用5/6肾切除法制备CRF大鼠模型,进一步探讨组方的合理性,以及在延缓CRF进展中的可能作用机制,为其临床治疗CRF提供可靠的实验依据。2.研究方法:2.1复方黄甘提取物制备部分药材加7倍量70%乙醇,浸泡30min,水浴加热回流2次,每次1.5h,合并滤液;另一部分药材加7倍量的水,浸泡2h,煎煮2次,每次2h,合并滤液浓缩,80%终浓度乙醇4℃醇沉24h,过滤上清液,沉淀用80%乙醇洗2遍,合并醇提和水提醇沉部分,旋转蒸发浓缩,后70℃真空干燥至干浸膏。共生产3批样品。灌胃前用蒸馏水配制,并用0.5%的CMC-Na增溶。高效液相色谱(HPLC)检测条件为,色谱柱:ZORBAXEclipsePlus-C18柱(4.6mm,150 mm,5μm),流动相(乙腈:水),水相从90%-10%线性梯度洗脱90min,检测波长为274nm,流速:0.8 mL·min-1,柱温:30℃,进样体积20μL。2.2 5/6肾切除模型大鼠的建立手术室紫外照射30min消毒,术前用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,注射剂量为0.7mL/200g。扇形切除左肾上下极各1/3,切面用吸收性明胶海绵止血。将残肾还纳于腹中,双层缝合关腹。1w后行右肾全切术。假手术组10只均只剥离左右肾被膜。术后两周,按体重分层随机区组法将60只5/6肾切除大鼠分成6组,每组10只,分别为模型组、尿毒清组、氯沙坦组、复方黄甘低、中、高剂量组。所有大鼠均给与普通饲料喂养,自由饮水。2.3给药及生化指标检测各组大鼠给药方法为:假手术组及模型组给予含0.5%的CMC-Na蒸馏水溶液,按1mL/100g灌胃;尿毒清组给予3.6g/kg/d尿毒清混悬液灌胃;复方黄甘高、中、低剂量组给予相应的复方黄甘混悬液灌胃(高剂量为14.4g/kg/d、中剂量为7.2g/kg/d、低剂量为3.6g/kg/d,低剂量组为临床等效剂量),每日一次。实验期间每周称取各组大鼠体重一次并观察动物进食、饮水、行为、精神状态、毛发及二便等情况。给药12w后,将各组大鼠麻醉行腹主动脉采血,收集血清。用全自动生化分析仪检测Scr、BUN、尿肌酐(Ucr)及24h尿蛋白(UPr),并对残余肾组织进行HE和Masson染色观察病理变化。2.4复方黄甘延缓大鼠CRF的作用机制收集给药12w后各组大鼠血清及肾组织。血清在4℃下放置0.5h,3000r/min离心15min,取上清液,按试剂盒说明测定各组大鼠血清中的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)等指标。取部分肾组织用4%福尔马林固定液固定,脱水包埋后检测组织中FN、ICAM-1和MCP-1的表达。另取部分肾皮质,提取总RNA,检测其中FN、ICAM-1和MCP-1基因的表达。3.研究结果:3.1复方黄甘提取物含量测定复方黄甘1g浸膏相当于4g原药材,3批样品中成分及含量均较稳定。HPLC分析其主要成分及其含量为:甘草苷(0.06%)、丹皮酚(1.06%)、芦荟大黄素(0.1%)、大黄酸(0.47%)、大黄素(0.19%)、大黄酚(0.41%)和大黄素甲醚(0.13%),其中丹皮酚含量最高,大黄中提取的成分较多。3.2大鼠体征变化给药12w后模型组大鼠皮毛暗淡稀疏,耳尾苍白,体重略轻于其他各组。其他组大鼠体毛光滑,体型健壮,体重逐步上升。但各组体重均无统计学差异(P>0.05)。3.3生化指标差异各组残余肾重无统计学差异。除尿毒清组外,其他各治疗组肾脏指数(RI)均显著低于模型组(P<0.05)。模型组血肌酐Scr、尿素氮BUN、肌酐清除率(Ccr)及尿蛋白UPr都显著高于假手术组(P<0.01),Scr除氯沙坦组,其他各治疗组均显著低于模型组(P<0.05),且复方黄甘低、中、高剂量组还显著低于氯沙坦组(P<0.05)。各给药组肌酐清除率(Ccr)均显著高于模型组(P<0.01),且复方黄甘高剂量组高于氯沙坦组(P<0.05)。各组Upr显著低于模型组(P<0.01)。复方黄甘各给药组各生化指标与尿毒清组均无显著性差异(P>0.05)。HE染色结果显示,术后12w假手术组大鼠肾组织无病理改变,肾小球、肾间质及肾小管均无异常改变。而模型组大鼠肾组织中,肾小球和肾间质可见大量炎症细胞浸润,肾小球呈多灶状硬化,球囊黏连,系膜细胞增生。肾小管萎缩,可见蛋白管型,间质纤维化严重。复方黄甘各给药组肾小球、肾小管及肾间质均有不同程度的好转,肾小球硬化和肾间质纤维化改善较为明显。Masson染色结果显示,假手术组可见肾小球、肾小管结构清晰,形态正常,间质内少量胶原蛋白,未见增生;假手术组肾脏结构基本正常,肾间质内可见少量纤维组织增生;模型组可见肾小肾管扩张,被膜、肾小球、肾小管、肾间质内均有大量绿色物质沉积,提示大量胶原纤维增生;复方黄甘各给药组肾小球、肾小管及肾间质均有不同程度的好转,肾小球硬化和肾间质纤维化改善较为明显。3.4各组大鼠血清中氧化指标测定模型组大鼠血清中MDA含量显著升高,和假手术组比较有显著性差异(P<0.05);复方黄甘各给药组的MDA含量与模型组比较都显著下降(P<0.05)。与模型组对比,复方黄甘低、中、高剂量组肾组织中SOD含量显著上升(P<0.05)。复方黄甘各给药组MDA和SOD含量与尿毒清组和氯沙坦组均无统计学差异(P>0.05)。GSH含量与模型组对比,复方黄甘各给药组都有显著升高(P<0.05),且中、高剂量组高于尿毒清组(P<0.05),高剂量组高于氯沙坦组(P<0.05)。3.5各组大鼠肾组织中FN、ICAM-1及MCP-1基因和蛋白表达各给药组大鼠肾组织中FNmRNA的表达量均显著低于模型组(P<0.01),但都高于假手术组(P<0.05)。各给药组ICAM-1的表达均显著低于模型组(P<0.01),且各给药组之间和假手术组间均无统计学差异(P>0.05)。MCP-1的表达除尿毒清组,其他各组均显著低于模型组(P<0.05),且复方黄甘各给药组均高于假手术组(P<0.05),与尿毒清组无统计学差异(P>0.05)。免疫组织化学结果显示,FN在肾小球中表达较强,肾小管及肾间质中表达较弱,对其阳性表达的光密度值(IOD)进行半定量分析可知,模型组FN表达显著高于假手术组(P<0.01)及其他各给药组(P<0.05),各给药组之间无显著性差异(P>0.05)。而ICAM-1则在肾小管及肾间质中表达较强,肾小球表达相对较弱,且模型组阳性表达远高于其他各组(P<0.05),而尿毒清组、科素亚组及复方黄甘低剂量组表达更少(P<0.01)。MCP-1在各实验组大鼠肾组织中表达均较弱,但尿毒清组、科素亚组及复方黄甘高剂量组的阳性表达仍显著低于模型组(P<0.01)。免疫组化结果与PCR结果大体一致。4.结论:复方黄甘提取物能改善CRF大鼠的肾功能,减轻肾脏纤维化,延缓肾功能衰竭。复方黄甘提取物可降低CRF大鼠体内氧化应激水平,抑制趋化因子的表达,从而降低肾脏组织中纤维化水平,延缓大鼠慢性肾衰进展。