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光动力治疗在肿瘤治疗领域有着飞速的发展。光敏反应的发生需要光敏剂、光以及氧气三要素的参与。但实体瘤中不同部位的氧气含量并不一样,即肿瘤的缺氧不均一性。肿瘤缺氧对光动力治疗有两方面的影响:其一,在氧气含量较低部位,活性氧的产生受到严重影响,无法产生对肿瘤组织的杀伤作用;其二,单线态氧响应性的纳米药物富集于肿瘤部位后,缺氧导致载体结构无法改变,药物无法有效释放。因此,缺氧导致的单线态氧响应型释药困难和单线态氧生成减弱是肿瘤光动力治疗中亟待解决的难题。双敏感刺激响应与多敏感刺激响应的纳米载体在肿瘤靶向治疗领域中越来越受到重视。为克服实体瘤中缺氧不均一造成的纳米药物在肿瘤部位的单线态响应释药困难,单线态氧敏感和缺氧敏感的双敏感载体可以用来实现在肿瘤中不同氧气含量部位的应答型释药。据报道,硝基咪唑（Nitroimidazole,NI）可以在缺氧细胞中被硝基还原酶还原成氨基咪唑,其结构疏水性转变为亲水性导致硝基咪唑修饰的纳米粒子崩解,加速药物释放。我们之前的工作证明,硝基咪唑还可通过咪唑氧化途径与单线态氧发生反应,生成丙二醛的衍生物,其疏水性质被改变。将硝基咪唑修饰在如两亲性的多肽聚合物,或两亲性的两嵌段共聚物上面,通过自聚集方式形成疏水性内核和亲水性外端的纳米粒子,将光敏剂和其他联合治疗药物包载到疏水内核中,形成具有缺氧和单线态氧-双重响应的刺激响应性纳米药物。谷胱甘肽（Glutathione,GSH）能够防止由活性氧物质,自由基,过氧化物,脂质过氧化物和重金属引起的重要细胞组分的损害。GSH通过充当电子供体,将细胞质内有害的活性氧物质转化,并排除细胞外。在此过程中,谷胱甘肽转化为其氧化形式,即谷胱甘肽二硫化物（Glutathione disulfide,GSSG）。氧化性谷胱甘肽使用还原型辅酶NADPH作为电子供体,在谷胱甘肽还原酶作用下被还原成GSH。光敏反应能够生产活性氧,如二氢卟吩e6（Chlorin e6,Ce6）在与光和氧气的作用下生成单线态氧,并对细胞组分造成损伤。然而在GSH的还原作用下,会减弱单线态氧对细胞的杀伤作用,因此,降低细胞内谷胱甘肽的含量能增强单线态氧对细胞的杀伤作用。本实验室之前的工作表明,NI与甲氧基聚（乙二醇）-聚（天冬氨酸）（m PEG-PAsp）共聚物的侧链共价结合所形成的纳米粒子m PEG-PAsp-NI具有缺氧和单线态氧敏感的特性,并阐明了硝基咪唑单线态氧敏感的机理。硝基咪唑在与单线态氧反应后生成丙二醛衍生物,因此我们推测醛基毒性能够增强细胞凋亡。此外据报道,硝基咪唑在缺氧环境中,在NADPH的作用下被硝基还原酶还原成氨基咪唑。因此我们猜想m PEG-PAsp-NI的硝基咪唑结构在缺氧环境中被还原成氨基咪唑时能够通过引起NADPH的下降,从而诱导GSH的下降,从而增敏光敏治疗。采用之前的实验方法,利用载体m PEG-PAsp-NI在水中的自组装,将Ce6和阿霉素（Doxorubicin,DOX）一起包载于纳米粒子的疏水内核中,得到载药纳米粒NCs/DOX+Ce6。通过高效液相方法测定其载药量为DOX:2.5±0.2%（w/w）和Ce6:1.8±0.3%（w/w）。两者药物的载药总量达到4.3%,这与报道的纳米药物载药量一致。测定NCs/DOX+Ce6的光学特性,并与游离的DOX,Ce6以及空载纳米粒（Drug-free nanocarriers,NCs）的光学特性对比,发现游离药的特征峰与NCs/DOX+Ce6的特征峰相吻合,表明药物被成功包载于纳米粒子中。动态光散射分析NCs/DOX+Ce6与NCs的水合粒径分别为138.5±3.6 nm和109.7±3.7 nm,符合实体瘤高通透性和高滞留性（Enhanced permeability and retention effect,EPR）效应对于纳米粒子粒径的大小要求,同时也说明药物成功被包载于纳米粒的疏水空腔造成纳米粒子粒径变大。NCs/DOX+Ce6在光照刺激30 min后（660 nm激光,强度为100 m W/cm2）,粒径变为250.2±8.6 nm,实验结果表明,Ce6在光照下发生光敏反应生成了单线态氧,后者与纳米载体上的硝基咪唑反应导致载体结构破坏,纳米药物开始膨胀。测定NCs/DOX+Ce6在水,PBS,细胞培养基中的粒子大小变化以及在血清中的荧光变化发现,其粒径大小和荧光变化程度较小,证明NCs/DOX+Ce6在以上溶液中具有较好的稳定性。为验证NCs/DOX+Ce6的双敏感性,我们测定了其在光照下的体外药物释放,以及模拟缺氧条件的体外药物释放。利用Franz扩散池测定NCs/DOX+Ce6在光照和非光照的作用下的药物36小时释放累积量分别为Ce6:26.28±1.73μg/cm2,DOX:25.11±1.62μg/cm2和Ce6:10.48±1.08μg/cm2,DOX:11.61±0.75μg/cm2。表明硝基咪唑与光敏反应生成的单线态氧作用,导致胶束崩解,加速了药物的释放。使用连二亚硫酸钠（Na2S2O4）来模拟硝基还原酶的作用,在体外将硝基咪唑还原并破坏其结构。测定加入Na2S2O4后的NCs/DOX+Ce6溶液的紫外与荧光图谱发现,随着反应时间的延长,溶液紫外吸收与荧光发射增强,这表明了药物从纳米粒子中释放出来。即硝基咪唑被还原后,纳米粒子结构被破坏,从而导致药物加速释放。实验证明NCs/DOX+Ce6具有较好的双敏感作用。探针测定体外单线态氧的实验表明NCs/DOX+Ce6在光照发生强光敏反应,产生大量单线态氧。根据实验室之前对于醛基的检测方法发现,NCs/DOX+Ce6在光照刺激后,生成了丙二醛衍生物,这与我们之前的实验结果相一致。为在细胞水平上验证NCs/DOX+Ce6的各种特性,将小鼠乳腺癌细胞（4T1）作为细胞模型开展实验。细胞毒实验表明,非光照条件时,NCs/DOX+Ce6在缺氧的情况下对细胞的半抑制浓度(IC50)为7.34±0.87μg/m L(所有细胞毒IC50计算基于DOX当量);而在常氧情况下的细胞毒IC50在0-7μg/m L浓度范围没有得到有效IC50值,这证明在非光照时,NCs/DOX+Ce6能在缺氧的情况下释放药物起到细胞毒作用。光照条件时,NCs/DOX+Ce6在缺氧和常氧下的细胞毒IC50分别为4.78±0.48μg/m L,3.95±0.18μg/m L。表明光照能使纳米载体崩解,加速药物释放,同时单线态氧作用于细胞,增强了细胞毒作用。利用激光共聚焦的成像更加直观的看到细胞内的NCs/DOX+Ce6在光刺激和缺氧刺激下DOX与细胞核的共定位系数增高,表明药物在细胞内的加速释放。进一步测定细胞内的GSH含量的变化发现,在给药后,实验组NCs/DOX+Ce6和对照组硝基咪唑小分子组中,GSH的含量随着药物孵育的时间的增长而逐渐下降。表明在缺氧环境下,硝基咪唑在与NADPH和硝基还原酶的作用下被还原成氨基咪唑。随着NADPH的消耗,导致了GSH含量的下降。最后,我们选用Annexin V-FITC/PI试剂盒对细胞染色,用流式细胞术来分析药物诱导细胞的凋亡状况。结果表明,在缺氧组的实验中,NCs/DOX+Ce6在光照与不光照情况下其凋亡程度无较大差异（49.3%与43.0%,凋亡程度为早期凋亡和晚期凋亡的和值）,即不光照组在缺氧条件下,双敏感的纳米粒子的硝基咪唑在缺氧环境中被还原,胶束崩解导致药物释放,DOX发挥着细胞毒作用;NCs/DOX+Ce6被缺氧状态的细胞摄取后,在光照下仍有较少单线态氧产生,因此细胞毒要比非光照时要强。但相较于游离药组,NCs/DOX+Ce6组的细胞毒稍弱一些,这是因为细胞对游离药的摄取更强一些。常氧条件下,NCs/DOX+Ce6在没有光照时很难崩解,药物无法从胶束中释放。但是细胞中NCs/DOX+Ce6仍然会在相关酶的催化作用下,出现一定程度的崩解,因此出现了一定的程度细胞凋亡;光照刺激下,NCs/DOX+Ce6在光照下发生光敏反应,硝基咪唑转变成丙二醛衍生物,胶束崩解加速了药物的释放。同时由于氧气的消耗,进一步造成细胞缺氧,从而另一条刺激途径会发生,即硝基咪唑在硝基还原酶的作用下转变成氨基咪唑,胶束崩解加速药物释放。而且随着NADPH的消耗,GSH下降,使得细胞清除单线态氧的能力下降,增强了细胞凋亡。此外,我们在小鼠背部肿瘤建模,来评价药物在小鼠体内的生物分布以及药物的抗肿瘤作用。药物在生物体内的分布结果表明,在给药8小时之后NCs/DOX+Ce6组肿瘤部位的Ce6荧光出现最大值,并在24小时仍有较强荧光信号。说明NCs/DOX+Ce6有较好的生物相容性,肿瘤靶向性。以此为依据,我们选择在给药后8小时和24小时的时候进行对肿瘤部位光照治疗。在治疗后连续监测肿瘤大小和小鼠体重的变化。结果表明,相较于对照组PBS和游离药组,NCs/DOX+Ce6组的小鼠肿瘤生长率最低。首先,肿瘤对纳米药物具有EPR效应,能更好的摄取纳米药物;其次,肿瘤缺氧和光照能刺激药物释放和触发光敏反应发生,发挥药物抗肿瘤作用。对比光照与不光照组发现,游离药和NCs/DOX+Ce6的光照组治疗效果要比非光照组更强,这是因为在光照下,发生光敏反应产生单线态氧对细胞有作用,其次破坏纳米粒子的结构,加速药物释放,DOX发挥对细胞的杀伤作用。同时光敏反应进一步加强了肿瘤缺氧,增强药物的缺氧敏感释放。醛基的产生和GSH的诱导下降进一步增强NCs/DOX+Ce6的抗肿瘤作用。小鼠的体重的变化说明了NCs/DOX+Ce6有较强的生物相容性,小鼠的生理状态趋于稳定。治疗结束后,肿瘤组织的病理切片H&E染色和凋亡染色结果表明,不同药物在光照与不光照的治疗情况下药物治疗效果与小鼠肿瘤体积变化趋势所体现的治疗效果相一致,即NCs/DOX+Ce6在光照条件下能最大程度的限制肿瘤的生长。HIF-1α染色表明,NCs/DOX+Ce6组中的缺氧程度最严重,这是因为纳米载体的缺氧敏感消耗了氧气,以及光敏反应的发生极大程度的降低了氧气的含量,并破坏了肿瘤内的血管结构,导致其缺氧程度的增加。综上所述,为克服肿瘤缺氧不均一造成的释药困难,我们利用双敏感纳米载体m PEG-PAsp-NI包载光敏剂Ce6和化疗药DOX,成功的制备了纳米药物NCs/DOX+Ce6。实现了药物在体内肿瘤治疗的药物共递送以及可控释放。同时,基于前期硝基咪唑的单线态氧敏感以及缺氧敏感的反应机理的研究,我们推测了硝基咪唑其作为纳米载体的一部分,在响应刺激之后会增强药物治疗效果。即醛基毒的产生和GSH的诱导下降。我们在体外验证了这两个猜想,并且在细胞水平和动物肿瘤模型水平上加以验证,得到了NCs/DOX+Ce6对于细胞以及肿瘤组织具有最强杀伤作用的结论。其次,结果也表明了光动力反应和缺氧敏感之间的相互促进;m PEG-PAsp-NI更以一种多功能治疗角色增强了药物抗肿瘤效果,而不是简单的作为药物载体发挥作用。