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研究背景及目的胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)是消化系统常见恶性肿瘤之一,约占胰腺恶性肿瘤的90%以上。既往研究证实,诸如Hedgehog (HH)通路异常活化、炎症和K-ras突变等因素均参与了PDAC的形成过程。HH信号通路参与了胰腺形态发生过程,而在大多数正常胰腺中该通路处于沉默状态。但HH通路异常活化在PDAC中十分常见,且在早期即有表现。HH通路活化机制可大致分为①配体过表达介导的经典活化通路②以信号通路成员突变为主的非经典活化通路,其中前者较为常见。在人类,经典活化过程由HH通路配体Sonic Hedgehog (Shh)引发,最终导致HH通路核因子glioma-associated oncogene(Gli)家族蛋白入核,启动对下游基因的调控。在Gli家族中,Gli1是最主要的活化因子,Gli1入核是HH通路活化的标志。研究证实,炎症和PDAC的发生密切相关。核因子-κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)是炎症反应的重要成员,它参与了PDAC的发生、发展过程。NF-κB入核,NF-κB通路活化,从而启动对下游基因的调控。K-ras突变发生于PDAC早期。在PDAC中K-ras突变率颇高,可达75～95%。临床中发现,K-ras基因突变存在多个位点,但主要集中在第12、13密码子。K-ras蛋白只有在和三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate, GTP)结合后(K-ras-GTP)才能实现对细胞活性的调控。通常情况下K-ras-GTP蛋白会在GTP酶活化蛋白(GTPase-activating proteins, GAPs)的作用下迅速转变成无活性的K-ras-GDP,使K-ras蛋白处于失活状态。K-ras基因突变导致K-ras蛋白持续处于K-ras-GTP状态,使K-ras蛋白保持活化状态。既往研究证实上述三条通路参与PDAC的发病过程,HH通路和NF-κB间存在相关性,且NF-κB可活化HH通路,K-ras突变可导致HH通路和NF-κB的活化,但三者间在胰腺癌发生中相互作用及其机制却鲜见报道。探讨三者之间的相互作用机制,对深入了解PDAC发病的分子机制,寻求特异、有效的个体化治疗方法至关重要。据此,本课题开展了以下研究：第一部分PDAC组织和细胞株中HH与NF-κB通路主要成员表达和K-ras基因突变的检测、及三者之间相关性分析实验材料、方法：收集32例胰腺癌组织和3株PDAC细胞株,采用免疫组化、实时定量PC、western-blot和DNA测序技术,分别检测Shh蛋白和Gli1、NF-κB核蛋白的表达,以及K-ras基因12和13密码子突变情况。实验结果：在PDAC组织中存在Shh、Gli1和NF-κB表达量之间的正相关性,同时这种正相关性在K-ras突变的状态下显著存在,表明在PDAC发病中HH和NF-κB通路活化具有显著正相关性,并且这种相关性具有一定的K-ras突变依赖性；PDAC细胞中可能也存在HH通路和NF-κB通路活化的正相关性,并且这种相关性也可能具有一定的K-ras突变依赖性。第二部分PDAC细胞株中活化NF-κB通路对HH通路的调控作用观察,并分析此调控作用对K-ras突变的依赖性实验材料、方法：选取K-ras 基因野生(BxPC-3)和突变(Panc-1/12密码子突变；SW1990/13密码子突变)PDAC细胞进行干预,活化NF-κB通路的作用研究。对上述细胞株分别进行①白介素-1p(interleukin-1β, IL-1β)②肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-a, TNF-a)刺激干预(以单纯培养基处理组作为对照),采用q-PCR、Westernblot方法检测干预后Shh, Glil和NF-kB的mRNA和蛋白质表达变化,同时平行检测干预后细胞增殖、凋亡等变化,观察干预方法对NF-κB通路本身活化作用以及促进HH通路活化的作用效果,并分析这种作用效果与K-ras突变的相关性。实验结果：在K-ras突变的PDAC细胞株中,干预活化NF-κB通路后可促进HH通路进一步高度活化,并同时增强了PDAC细胞株的恶性细胞行为特征；但在K-ras野生的PDAC细胞株中,这种干预活化的作用效果不显著。研究表明,在PDAC发病中NF-κB通路活化可Crosstalk(串话)促进HH通路活化,并且此Crosstalk作用具有一定的K-ras突变依赖性。第三部分PDAC细胞株中活化-HH通路对NF-κB通路的调控作用观察、并分析此调控作用对K-ras突变的依赖性实验材料、方法：同第二部分研究,选取K-ras基因野生(BxPC-3)和突变(Panc-1/12密码子突变；SW1990/13密码子突变)的PDAC细胞株,分别进行①Gli1 cDNA转染过表达、②配体Shh刺激干预(以单纯培养基处理组作为对照),采用q-PCR、 Westernblot方法检测干预后Shh、Gli1和NF-κB的mRNA和蛋白质表达变化,同时平行检测干预后细胞增殖、凋亡等变化,观察干预方法对HH通路本身的活化作用以及促进NF-κB通路活化的作用效果,并分析这种作用效果与K-ras突变的关系。实验结果：在K-ras突变的PDAC细胞株中,干预活化HH通路后可促进NF-κB通路进一步高度活化,并同时增强了PDAC细胞株的恶性细胞行为特征；但在K-ras野生的PDAC细胞株中,这种干预活化的作用效果不显著。研究表明,在PDAC发病中HH通路活化可Crosstalk (串话)促进NF-κB通路活化,并此Crosstalk作用具有一定的K-ras突变依赖性。第四部分PDAC中HH通路和NF-κB通路之间Crosstalk的K-ras突变依赖性的分子机制研究实验材料、方法：在上述第二和三部分的细胞干预实验基础上,进一步检测细胞中K-ras蛋白及活性表达变化,检钡K-ras基因下游基因p-/t-ERK1/2,和p-/t-AKTl的表达变化,并利用Ras活性检测试剂盒检测Ras活性变化,综合判断K-ras通路的活化水平变化；同时分别采用RNA干扰技术(si-Kras)阻断PDAC细胞内K-ras基因的表达,和采用G12D突变型K-ras基因cDNA质粒转染野生型细胞,观察这些阻断和补救的反向措施对K-ras本身活性的干预成功性,及对Crosstalk相互促进活化的影响,进一步确定HH和NF-κB通路之间相互促进活化的Crosstalk的K-ras突变依赖性的分子机制。实验结果：K-ras活性改变是HH和NF-κB通路活化及二者间Corsstalk对K-ras突变依赖的主要分子机制。第五部分PDAC中HH通路和NF-κB通路之间Crosstalk的K-ras突变依赖性的动物研究实验材料、方法：在细胞学研究基础上,我们进行动物实验,以深入探讨HH通路和NF-κB通路之间Crosstalk的K-ras突变依赖性。我们利用①Glil cDNA稳转的SW1990细胞和普通SW1990细胞种植于胸腺缺失的裸鼠,检测Gli1和NF-κB核蛋白表达,观察Gli1过表达,HH通路活化对NF-κB通路的影响；同时平行检测肿瘤大小,验证HH通路活化对肿瘤生长的影响；②分别以K-ras基因野生(BxPC-3)和突变(Panc-1/12密码子突变；SW1990/13密码子突变)的PDAC细胞种植于胸腺缺失的裸鼠,成瘤后分别以PBS(对照)、Shh、IL-1β和TNF-a刺激裸鼠,检测Shh蛋白表达以及Gli1和NF-κB核蛋白表达,观察不同K-ras表型细胞对HH通路和NF-κB通路活化,以及二者间的crosstalk;同时平行检测肿瘤大小,验证HH通路和NF-κB通路活化对肿瘤生长的影响。实验结果：①K-ras突变的PDAC细胞中,Gli1过表达、HH通路活化可促进NF-κB通路活化,并促进肿瘤生长；②K-ras突变的PDAC细胞中,存在HH通路和NF-κB通路的crosstalk。研究提示,动物体中,也存在HH通路和NF-κB通路的Crosstalk的K-ras突变依赖性。全文结论1、PDAC中,K-ras基因12、13密码子突变在PDAC组织中发生率高(81.25%)；HH通路和NF-κB通路活化间的显著正相关关系存在K-ras突变依赖性；2、PDAC中,NF-κB通路活化,以及其对HH通路的活化作用存在K-ras突变依赖性；3、PDAC中,HH经典活化通路,以及其对NF-κB通路的活化作用存在K-ras突变依赖性；4. PDAC中,K-ras活性改变是PDAC中HH通路和NF-κB活化及二者间相互活化作用K-ras突变依赖性的主要机制；5、动物实验证实HH经典活化通路,NF-κB通路活化,以及二者间相互活化作用的K-ras依赖性。