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目的建立实时定量PCR(RQ-PCR)方法检测初诊急性早幼粒细胞白血病(APL)忠者PML/RARα融合基因亚型(Long-form、Short-form和Variant-form)及其特异性异构体(bcrl/2、P4R3、P46R3、bcr3和P2R3),并探讨融合基因亚型和特异性异构体表达水平的临床意义。方法根据“欧洲抗癌计划”设计TaqMan探针和引物,建立RQ-PCR方法对长型(Long-form)、短型(Short-form)、变异型(Variant-form)三种类型PML/RARα阳性模板进行扩增,检测51例初诊APL患者PML/RARα转录本含量,并对检测结果进行凝胶电泳和测序;设计不同异构体的特异性引物,建立异构体特异性RQ-PCR方法对6种特异性异构体PML/RARα阳性模板进行扩增,评价异构体定量检测的特异性,并检测45例初诊APL患者中不同异构体的含量。结果51例APL初诊患者中,33例为长型PML/RARα阳性患者,3例为变异型PML/RARα阳性患者,15例为短型PML/RARα阳性患者。患者外周血白细胞计数与年龄呈负相关(R=-0.376,P=0.014),相关性主要见于长型和变异型患者(R=-0.51,P=0.005)。短型患者外周血白细胞计数明显高于长型患者(P=0.041)。而两组患者在性别、年龄、外周血血红蛋白含量、血小板计数,骨髓原始粒细胞及早幼粒细胞比例、获得血液学完全缓解时间和分子生物学完全缓解时间等方面无统计学差异。所建立的检测PML/RARα转录本各亚型的RQ-PCR方法最大敏感性均达10拷贝/μl,但其重复性较差,10~8-10~2拷贝/μl阳性模板的重复性良好。正常对照及空白对照无扩增信号。36例长型和变异型APL初诊患者PML/RARα转录本绝对含量为3.75×10~2-6.20×10~5拷贝/50 ng(中位7.24×10~3拷贝/50 ng),相对含量为0.51%-676.87%(中位9.31%)。15例短型患者PML/RARα转录本绝对含量为2.26×10~3-2.33×10~6拷贝/50 ng(中位1.17×10~5拷贝/50 ng),相对含量为12.04%-802.68%(中位95.26%)。短型患者体内融合基因相对含量明显高于长型患者(P<0.01)。33例随访患者获得血液学完全缓解时间与分子生物学完全缓解时间与患者的年龄、外周血白细胞数及融合基因含量无相关性。“欧洲抗癌计划”推荐的短型RQ-PCR反应体系能扩增筑巢式PCR检测为长型、变异型和短型的PML/RARα转录本,变异型反应体系能扩增筑巢式PCR检测为长型和变异型的PML/RARα转录本,长型反应体系仅能扩增筑巢式PCR检测为长型PML/RARα转录本;电泳及测序结果揭示短型RQ-PCR反应体系扩增筑巢式PCR检测为长型PML/RARα的患者标本可见3条条带(621 bp、477 bp和218 bp),扩增筑巢式PCR检测为变异型PML/RARα的患者标本也可见3条条带(567 bp、423 bp和218 bp)。长型患者和变异型患者同时含有P4R3和P46R3异构体,短型患者同时含有P2R3异构体。鉴于上述结果,我们进一步建立了检测PML/RARα转录本6种特异性异构体的RQ-PCR方法,最大敏感性均达10拷贝/μl,但其重复性较差,10~8-10~2拷贝/μl阳性模板的重复性良好。正常对照及空白对照无扩增信号。每个异构体特异性RQ-PCR均不能将其它异构体扩增出。45例APL初诊患者中,长型和变异型患者31例,其bcr1/2的绝对定量为1.73×10~2-7.65×10~4拷贝/50 ng(中位2.14×10~4拷贝/50 ng),相对定量为0.86%-208.01%(中位11.61%);P4R3的绝对定量为7.3×10~2-1.38×10~5拷贝/50 ng(中位1.46x10~4拷贝/50 ng),相对定量为0.71%-266.19%(中位18.13%);P46R3的绝对定量为1.65×10~2-1.05×10~5拷贝/50 ng(中位1.41×10~4拷贝/50 ng),相对定量为0.53%-222.90%(中位8.65%)。14例短型患者bcr3的绝对定量为7.53×10~2-3.22×10~5拷贝/50 ng(中位6.07×10~4拷贝/50 ng),相对定量为11.91%-326.55%(中位58.03%);P2R3的绝对定量为48.87-1.39×10~4拷贝/50 ng(中位8.72×10~2拷贝/50 ng),相对定量为0.02%-57.71%(中位0.93%)。短型患者bcr3的表达量明显高于长型、变异型患者bcr1/2的表达量(P=0.001)。长型患者中,bcr1/2、P4R3及P46R3三种异构体表达量的高低无统计学差异(P=0.344),bcr1/2及P4R3的表达量均与P46R3相关(R值分别为0.73和0.5,p值分别<0.001和=0.04),但两者间表达水平无相关性。14例短型患者均含有低水平P2R3表达,其表达量明显低于bcr3(P<0.001),但两者间并无相关性(P=0.714)。患者获得血液学完全缓解时间和分子生物学完全缓解时间与融合基因特异性异构体的表达量无明显相关性。1例短型患者经诱导治疗缓解后bcr3和P2R3异构体转录本明显下降,复发时又显著升高。结论PML/RARα融合基因各亚型和特异性异构体的RQ-PCR检测方法敏感、可靠,可用于APL患者的诊断和MRD随访监测。