【研究背景及目的】小胶质细胞是中枢神经系统的固有免疫细胞，其在维持中枢神经系统微环境的动态平衡中扮演重要角色。近年来，研究认为神经元—小胶质细胞的神经网络失衡与神经元损伤及中枢神经系统退行性疾病密切相关。其中，小胶质细胞活化后介导的神经炎症反应和氧化损伤已成为中枢神经系统疾病的研究热点之一。目前，越来越多的研究证实活化的小胶质细胞可促进一氧化氮（nitricoxide,NO）、肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α,TNF-α）等炎症因子的释放。然而，小胶质细胞活化的调控及其介导神经炎症反应的分子机制十分复杂，尚待进一步研究阐明。蛋白酶激活受体2（protease-activatedreceptor2,PAR2）是与G蛋白相偶联的受体，属于蛋白酶激活受体（protease-activatedreceptors,PARs）家族成员之一，主要被胰蛋白酶和类胰蛋白酶等激活，其独特的激活方式及广泛的病理生理作用，使其有望作为重要的药物干预靶点而受到越来越多关注。近年来，研究发现PAR2广泛分布于中枢神经系统，在中枢神经系统损伤和退行性疾病等病理过程中扮演重要角色。目前，研究人员普遍认为在中枢神经系统中PAR2的激活可表现出“保护”和“损害”的双重作用，并推测其可能与细胞类型及疾病所处的病理阶段不同等因素相关，但具体作用机制仍不明确。最近研究发现，胰蛋白酶可激活星形胶质细胞表面PAR2，通过MAPK-NF-κB通路促进NO的合成与释放。目前，针对小胶质细胞PAR2激活介导神经炎症反应的研究还十分有限。我们前期研究中发现，活化的肥大细胞可释放类胰蛋白酶激活小胶质细胞表面PAR2，引起小胶质细胞活化，小胶质细胞活化后同样通过MAPK通路促进BDNF的合成与释放。因此，我们推测外源性添加类胰蛋白酶可激活小胶质细胞表面PAR2，进而促进小胶质细胞合成和释放NO、TNF-α等炎症因子，介导神经炎症反应，导致周围神经元损伤。综上所述，鉴于小胶质细胞在中枢神经系统免疫炎症反应中的重要作用，本课题通过体外原代细胞培养等技术，研究类胰蛋白酶激活小胶质细胞PAR2后不同时间点NO、TNF-α、IL-1β等炎症因子的释放情况，并观察其对体外培养神经元存活的影响，旨在探索PAR2在小胶质细胞活化及其介导神经炎症反应中的作用，也期望为开发更有效的中枢神经系统损伤防治新策略提供作用靶点，具有理论和临床意义。【研究方法】1.类胰蛋白酶干预小胶质细胞，检测不同时间点培养上清液中BDNF、IL-1β、TNF-α及NO的含量体外分离纯化培养大鼠皮质原代小胶质细胞，添加类胰蛋白酶（Tryptase）20U/ml，随后分别在第0，0.5，1，2，12，24和72h收集小胶质细胞培养上清液（microgliaconditioningmedium,MCM），通过ELISA法检测上清液中BDNF、IL-1β及TNF-α含量，Griess法测定上清液中N02-含量作为衡量NO水平的指标。2.利用PAR2特异性激动剂、抑制剂及RNA干扰技术，探索PAR2在类胰蛋白酶激活小胶质细胞介导炎症反应中的作用体外分离纯化培养大鼠皮质小胶质细胞，实验分4组。对照组；实验组一：体外培养小胶质细胞+SLIGRL-NH2（PAR2特异性激动剂）；实验组二：体外培养小胶质细胞+FSSRY-NH2（PAR2特异性抑制剂）+Tryptase；实验组三：体外培养小胶质细胞+PAR2shRNA+Tryptase，24h后收集细胞培养上清液，Griess法测定比较不同组别NO水平。3.类胰蛋白酶激活小胶质细胞对体外培养神经元存活的影响体外分离培养大鼠皮质神经元，实验分3组。对照组：体外培养神经元+未经类胰蛋白酶处理的MCM；早期组：体外培养神经元+类胰蛋白酶处理后第1h收集MCM；晚期组：体外培养神经元+第72h收集的MCM，再培养神经元48h，随后通过流式细胞技术和TUNEL染色检测神经元凋亡情况。4.统计学处理数据使用SPSS13.0统计软件进行分析，结果以X±SD表示。多组间比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA），p≤0.05认为差异具有统计学意义。【研究结果】1.类胰蛋白酶干预早期BDNF释放短暂性升高，晚期TNF-α等炎症因子含量逐渐增加检测结果显示，类胰蛋白酶激活小胶质细胞后早期MCM中BDNF含量迅速增加，在1h释放达到高峰，但72h内逐渐下降至起始水平；与之相反，IL-1β、TNF-α及NO的含量则随时间推移逐渐升高，在最后一次测量时间点（72h）仍保持较高水平。2.类胰蛋白酶通过激活小胶质细胞PAR2介导炎症反应PAR2特异性激动剂SLIGRL-NH2显著增加小胶质细胞培养上清液中NO的含量，与对照组相比较差异具有统计学意义（11.24±1.09VS2.25±0.26，p<0.05）；用PAR2抑制剂和慢病毒预处理小胶质细胞后，再用类胰蛋白酶干预小胶质细胞，培养上清液中NO的含量与对照组相比，无明显差异（2.53±0.40VS2.25±0.26，p>0.05；2.25±0.27VS2.25±0.26，p>0.05），表明类胰蛋白酶是通过激活PAR2介导小胶质细胞NO的释放。3.类胰蛋白酶干预晚期的MCM促进体外培养神经元凋亡流式细胞术检测结果：晚期组神经元凋亡率明显增加，与对照组和早期组相比较差异具有统计学意义（13.60%±1.51%VS3.33%±0.51%，p<0.05；13.60%±1.51%VS3.27%±0.42%，p<0.05）；而早期组和对照组相比较，神经元凋亡率差异无统计学意义（3.27%±0.42%VS3.33%±0.51%，p>0.05）。TUNEL染色结果：晚期组免疫荧光强度和阳性细胞数明显高于对照组和早期组，差异具有统计学意义（17.67%±0.45%VS5.57%±1.35%，p<0.05；17.67%±0.45%VS6.67%±0.47%，p<0.05）。【研究结论】类胰蛋白酶可激活小胶质细胞PAR2使其从静息状态转为活化状态，释放BDNF及TNF-α等细胞因子。类胰蛋白酶激活小胶质细胞介导的神经炎症反应与时间因素有关，激活早期BDNF释放呈短暂升高，但随后迅速下降，活化晚期则促进TNF-α等炎症因子大量释放，导致周围神经元凋亡。然而，类胰蛋白酶激活小胶质细胞PAR2在中枢神经系统损伤中的作用仍需要进一步在动物实验中进行验证。