奶牛乳腺炎作为奶牛养殖业中发病率较高、造成巨大经济损失的疾病之一。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,下文简称金葡菌）是导致奶牛乳腺炎的主要病原之一。β溶血素（βhemolysin,hlb）是金葡菌分泌的外毒素,可以协助金葡菌定植在牛乳腺细胞和造成乳腺细胞损伤。单链抗体（single chain fragment variable,scfv）是近年来受到高度重视的新型基因工程单价小分子抗体之一,研究和应用前景广阔。有研究表明,靶向阻断分泌性毒力因子可以为机体提供更有效的保护,通过筛选针对β溶血素的单链抗体并研究其保护作用对预防奶牛乳腺炎具有重要的科学意义和应用价值。本文针对金葡菌β溶血素的单链抗体筛选及其保护作用主要进行了以下几个方面的研究:1.重组β溶血素的表达、纯化及溶血活性验证。提取金黄色葡萄球菌ATCC25923的DNA为模板,PCR扩增编码β溶血素的基因,构建原核表达质粒p ET32a-hlb,诱导表达获得重组hlb蛋白。将重组hlb蛋白与2%奶牛红细胞孵育后,通过测定红细胞悬液离心后上清的OD450判定重组hlb的溶血活性。实验结果表明,重组hlb具有溶解奶牛红细胞的活性,溶血作用随β溶血素浓度增高而增强（P<0.05）。2.针对β溶血素的单链抗体的筛选及体外活性的验证。利用重组hlb蛋白从牛源单链抗体噬菌体文库中筛选并原核表达、纯化获得了针对β溶血素的单链抗体。将单链抗体分别与重组β溶血素和金葡菌培养物上清孵育后加入2%奶牛红细胞反应,测定红细胞悬液离心后上清OD450判定单链抗体体外抑制β溶血素溶血作用的活性。实验结果证明,单链抗体能显著抑制重组hlb蛋白的溶血活性（P<0.001）。单链抗体可以在一定程度上抑制金葡菌培养物上清的溶血作用（P<0.05）。3.单链抗体对金葡菌感染小鼠乳腺具有保护作用。单链抗体可以抑制金葡菌在小鼠乳腺中的定植和扩增,减轻乳腺组织损伤,调节乳腺局部免疫反应。乳腺组织细菌计数结果显示,金葡菌感染后48h后,阴性对照组乳腺组织内细菌数量增加,而青霉素和单链抗体预防后再感染金葡菌,小鼠乳腺组织中的细菌数量显著减少（P<0.05）。HE组织切片染色结果显示,金葡菌感染后阴性对照组乳腺腺泡结构破坏严重,炎性细胞大量浸润,青霉素和单链抗体预防组的小鼠乳腺组织损伤减轻,腺泡结构较完整,腺泡内炎性细胞浸润数量减少。抗体生物安全组乳腺腺泡结构完整,腺泡内有少量炎性细胞浸润。巨噬细胞免疫组化染色结果显示,与空白对照组相比,金葡菌感染小鼠后,阴性对照组乳腺组织中巨噬细胞数量显著增加（P<0.05）。青霉素和单链抗体预防组的乳腺组织中巨噬细胞数量与阴性对照组相比显著减少（P<0.05）,且集中在腺泡破坏的部位。抗体生物安全组巨噬细胞数量显著增加（P<0.05）单链抗体调节了乳腺组织局部细胞因子的表达。与阴性对照组相比,青霉素和单链抗体预防组的小鼠乳腺组织的IL-18含量显著减少（P<0.05）,而青霉素预防组IL-8的含量显著增加（P<0.05）,单链抗体预防组IL-8含量有降低的趋势,但无显著差异。抗体生物安全组IL-8和IL-18含量显著升高（P<0.05）。综上所述,抗金葡菌β溶血素单链抗体可以通过靶向阻断β溶血素的作用,抑制金葡菌在乳腺中的扩散,同时调节巨噬细胞浸润和细胞因子的表达在一定程度上保护乳腺感染金黄色葡萄球菌。