目的：缺血性脑卒中(ischemic stroke)是由于血栓或动脉栓塞引起的脑血容量不足而出现的一过性脑病。脑缺血启动一系列生化分子机制,包括兴奋性氨基酸毒性、离子失衡以及自由基反应等等,最终造成脑功能失调。这一病理过程中,缺血时间和脑组织的耐受性显得至关重要,有研究报道大鼠遭受20至30min的全脑缺血就可以导致脑组织损伤。神经元细胞对低氧或低糖较为敏感,海马CA1区神经元已被证实是缺血最易损伤的区域,10min的短暂缺血就可以造成71.6%的神经元坏死和空间学习记忆能力的缺失。脑缺血所导致的认知功能损害成为了脑卒中患者急需解决的一大难题。盐酸椒苯酮胺(Piperphentonamine hydrochloride, PPTA;化学名称：(E)-5-{(3,4-亚甲二氧基苯乙基)甲氨基}-1-对羟基苯基-1-戊烯-3-酮盐酸盐)为一用来治疗心力衰竭和缺血性心脏病的新型钙增敏剂类药物,其药效与已上市的心血管药物levosimendan相似。近期研究报道了levosimendan呈剂量依赖性地减轻创伤性脑损伤,进而提供神经保护作用。现有的药效学资料显示：PPTA且有不增加细胞内钙离子浓度、可通过增大血管平滑肌细胞钙敏感钾通道电流产生舒血管作用的特点。同时,PPTA在猫和大鼠的心肌缺血/再灌注损伤模型上具有良好的抗缺血作用。基于此,我们假设PPTA不仅能给缺血心肌提供保护作用,还能够减轻缺血对脑组织造成的损伤。因此,本实验建立大鼠全脑缺血/再灌注损伤模型,观察PPTA对大鼠海马区神经元损伤情况及学习记忆能力的影响；同时建立体外海马神经元和PC12细胞氧糖剥夺损伤(oxygen-glucosedeprivation, OGD)模型,观察PPTA对细胞形态及细胞活力的影响。方法：(1)采用Pulsinelli四血管法(4-vessel-occlusion,4-VO)制作全脑缺血模型。健康雄性SD大鼠,造模成功后随机分为正常对照组、缺血再灌组(I/R)、PPTA剂量组(2.5、5、10mg/kg)。再灌注2h腹腔注射给药。Morris水迷宫和避暗实验测定大鼠学习记忆能力；病理切片Nissl染色观察海马神经元细胞丢失情况；试剂盒检测海马匀浆乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)的含量；Real-time PCR检测海马诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、bcl-2以及bax基因表达情况。(2)体外培养海马神经元和PC12细胞,分别采用物理和化学两种方法建立细胞氧糖剥夺损伤模型,观察细胞形态学变化；四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法检测不同浓度PPTA对细胞活力的影响；测定细胞外液LDH和NO的浓度；Real-timePCR检测细胞iNS、caspase-3、bcl-2及bax基因表达情况；Western blot测定iNOS蛋白水平。结果：1、大鼠全脑缺血/再灌注损伤实验(1) Morris水迷宫定向航行试验中,随着学习时间的延长,各组大鼠的逃避潜伏期均有所减少,从d3开始出现统计学差异,表现为模型组大鼠较假手术组显著延长,PPTA5和10mg/kg组较模型组显著减少。这说明全脑缺血损伤造成大鼠空间学习记忆能力显著下降,而给予PPTA药物治疗后能够改善大鼠记忆缺失的情况。空间探索试验中,假手术组探索时间显著长于模型组,除PPTA2.5mg/kg组无显著性差异外,PPTA5和10mg/kg组与模型组比较均有统计学意义。整个实验过程中各组大鼠的游泳速度没有出现显著性差异,这表明大鼠学习记忆能力的缺失与自身原因无关,同时PPTA能增强术后大鼠的空间学习记忆能力。避暗实验中,由于大鼠的趋暗习性,表现为训练时期各组大鼠进入暗箱的时间没有显著性差异,假手术组遭受电击24h后潜伏期显著延长,显示大鼠对电击损伤形成记忆；而模型组大鼠较假手术组显著缩短,PPTA5和10mg/kg组能有效地缓解缺血大鼠的长时记忆缺失。(2)行为学实验结束后大鼠海马进行Nissl染色,假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞形态完整,着色均一,排列紧密而有规则；模型组少见形态规则细胞,核固缩深染,排列紊乱；给予PPTA后海马神经元损伤显著减少,表现为PPTA5和10mg/kg组可见形状规则、胞浆完整的锥体细胞,神经元细胞密度显著升高。(3)全脑缺血损伤后大鼠脑组织内LDH水平显著升高；PPTA5和10mg/kg组可显著降低海马LDH水平。(4)Real-time PCR结果显示PPTA中高剂量组能不同程度的下调caspase-3,bax和iNOS基因的表达,上调促凋亡基因bcl-2的表达。2、离体神经元氧糖剥夺损伤实验(1)PC12细胞采用20mmol/LNa2S2O4诱导,氧糖剥夺4h再复氧24h；原代海马神经元细胞采用物理缺氧建模。MTT结果显示：OGD损伤后细胞活力显著下降,PPTA处理组(3,6和12μmol/L)能显著提高细胞活力,并呈现出一定的剂量依赖性。(2)OGD损伤后,PC12细胞和原代海马培养上清液中LDH和NO的含量显著增加；PPTA处理组能减轻细胞损伤。(3)形态学观察发现OGD损伤后神经元细胞形状变圆、突触减少或消失,以及细胞数量显著减少,而PPTA处理后这一损伤显著减轻。(4)Real-time PCR的结果显示：PPTA能够降低OGD诱导的抗凋亡基因bcl-2降低、促凋亡基因bax,caspase-3以及iNOS基因表达升高。(5)同时western blot结果表明PPTA能降低iNOS蛋白的表达水平。结论：目前的实验数据表明PPTA能够改善脑缺血损伤带来的记忆缺失和海马神经元丢失,这可能是通过其抗凋亡作用以及抑制iNOS-NO通路的表达来实现的。我们推测PPTA缓解记忆缺失的作用与海马神经元的密度有关。新型钙增敏剂PPTA对缺血／缺氧损伤神经元细胞的良好保护作用,为脑缺血损伤带来新的治疗方案。