第一部分:胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的原代培养及鉴定目的:建立原代培养的方法,即从孕19天胎鼠体内分离、纯化、培养获取胎鼠肺泡 Ⅱ 型上皮细胞(Fetal alveolar type Ⅱ epithelial cells,AECⅡ)。方法:清洁级SD大鼠,自然受孕后喂养至孕19天,剖腹取出胎鼠,分离得到胎鼠肺组织,采用胰蛋白酶、Ⅳ型胶原酶依次进行消化,采用差速离心、差速贴壁、IgG免疫粘附方法分离、纯化得到AECⅡ,培养细胞24h、48h、72h、96h,倒置显微镜下观察细胞的形态变化;透射电镜下观察细胞的超微结构;采用免疫荧光技术,激光共聚焦显微镜下观察肺表面活性物质(SP-C)、水通道蛋白5(AQP-5)的表达。本实验对细胞鉴定所采用的是透射电镜及免疫荧光-激光共聚焦法。结果:细胞形态:细胞悬液培养8小时后,部分细胞沉于皿底开始贴壁,形状似“小岛”,可以清楚分辨胞内细胞核及核仁;培养24小时,单个细胞呈现多边形化,细胞体积开始增大,但仍可以明显看清胞核及核仁;培养48小时,细胞数量较前增多,视野下可见双核细胞,相邻岛状细胞连接到一起,像铺路石样在瓶底铺开;培养96小时,细胞膜周边出现伪足,细胞折光性减弱,细胞轮廓变模糊,空泡明显。免疫荧光:绿色荧光蛋白标记的SP-C在24小时始见于细胞质中,在48小时时表达最强,后逐渐减弱。红色荧光蛋白标记的AQP-5在48小时仅有微弱表达,后逐渐增强,在96小时时表达最强。细胞超微结构:培养24h,细胞内可见到AECⅡ具有特征性的结构微绒毛和板层小体;72小时,细胞转分化成为一种中间状态。结论:采用胰蛋白酶、Ⅳ型胶原酶联合消化、差速离心、差速贴壁以及免疫粘附方法能够获取肺泡Ⅱ型上皮细胞,可应用于后续的实验研究中;透视电镜及免疫荧光方法可达到鉴定AECⅡ的目的。第二部分:维甲酸对高氧致AECⅡ损伤的影响及机制研究目的:研究维甲酸(Retinoic Acid,RA)干预对高氧暴露下AECⅡ细胞的影响及探讨其影响机制是否与活化的经典Wnt信号通路有关。方法:分离、纯化怀孕19天大鼠的AECⅡ细胞,计数板种板后培养24h后,进行电镜鉴定细胞,按照随机分组原则,将细胞分为以下3组:1.空气组:将细胞置于5%CO2、21%O2的培养箱中培养;2.高氧组:将细胞置于密闭氧仓中培养,即设置O2含量为95%,CO2含量为5%;3.高氧+RA组:细胞培养液中预先加入10-6mol/L的维甲酸,培养条件同高氧组。其他两组放入含有相同终浓度的DMSO。将随机分组的细胞放入培养箱继续培养24小时。光学显微镜下观察细胞的生长形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡情况,实时定量PCR法检测Wnt通路中Wnt7b、β-cateninmRNA的表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Wnt通路中Wnt7b、β-catenin蛋白的表达水平。结果:与空气组相比,高氧组培养24h,倒置显微镜下可见AECⅡ细胞间隙变化,空泡明显,折光性减弱,部分细胞出现脱壁;RA干预后,细胞在形态上观察与空气组相似,仍可以看到细胞与细胞之间的间隙增宽,但是空泡减少,贴壁细胞数量较高氧组增多。流式细胞术显示,高氧组AnnexinV(+)PI(-)和AnnexinV(+)PI(+)双标记的AECⅡ数高于空气组,RA组所标记的细胞数少于高氧组,具有显著降低细胞凋亡率的作用(P<0.05)。PCR结果显示高氧组培养24小时,细胞内Wnt7b、β-catenin mRNA表达水平降低,而加入RA干预后,其表达水平有所升高(P<0.05)。进一步完善Western blot发现,高氧组细胞内Wnt7b、β-catenin蛋白的表达也有相应的降低,加入RA后,其表达水平升高,但均低于空气组(P<0.05)。以上表明RA对高氧肺损伤起到保护作用可能与激活Wnt经典通路有关。结论:RA对高氧引起的肺损伤有保护作用,其可能通过激活Wnt信号通路参与保护作用。