目的糖尿病是一种以Th1淋巴细胞激活为特征的自身免疫性疾病,从而导致胰岛内淋巴细胞侵、胰岛β-细胞的程序性死亡,由于并发症多,严重危害人类健康。胰岛β-细胞替代疗法是恢复血糖正常及减轻糖尿病并发症的唯一途径。胰岛移植是一种侵入性最小的胰岛β-细胞替代疗法,目前胰岛移植其短期成功率有所提高。但是,从移植的长期效果来看,移植的胰岛缺乏代谢活性。研究表明在同基因系的胰岛移植模型中接近60%的β-细胞经受凋亡,其中一半发生在移植后3天。胰岛移植后的凋亡率是正常胰腺内胰岛的10倍。有几种原因导致了移植胰岛的丢失,如自身免疫攻击的复发所至的胰岛死亡;移植胰岛再血管化的延迟建立所至的移植物持续缺氧;组织因子的产生和释放所至的凝血系统的激活以及炎症等等。此外,胰岛制备的质量对移植胰岛功能的恢复起主要作用。胰岛分离时,促炎性细胞因子的释放,胰岛微环境的改变使胰岛受到各种各样的细胞应激,从而使胰岛β-细胞的功能和活性受损。在胰岛分离后很快就会出现胰岛细胞的凋亡而且主要累及到β-细胞。因此,在胰岛的分离和培养过程中加入不同的保护因素以提高胰岛的活性和功能是我们的研究目标。牛磺酸(taurine TAU)是一种含硫氨基酸,几乎全部以游离形式存在,细胞内外浓度比为100-50000/1,是一种细胞保护剂,具有重要生物学作用:清除氧自由基,抗脂质过氧化损伤,抑制细胞凋亡和直接膜保护作用,能够调节细胞钙稳态,对线粒体结构和功能起稳定作用,维持细胞内外渗透压平衡,抑制细胞因子的产生。在本实验中我们通过RT-PCR检测方法观察胰岛分离纯化过程中促炎性细胞因子、趋化因子、核转录因子的表达情况及对胰岛活性和功能的影响;培养后细胞因子、核转录因子的变化情况以及对胰岛免疫原性、活性和功能的影响。观察牛磺酸对促炎性细胞因子、趋化因子、核转录因子及粘附分子基因转录的影响、对体外培养胰岛的活性和功能的影响;探索其对胰岛的保护作用及机制。另外,大鼠胰岛β-细胞表达α1β1、α3β1、α5β和α6β1整合素,能和细胞外基质中的Arg-Gly-Asp三肽序列(RGD)结合介导细胞内外的信号传递;影响细胞的生存。本实验中我们还观察RGD对分离纯化后的胰岛活性和功能的影响。材料与方法胰岛的分离和纯化:普通级封闭群Wistar大鼠,雌雄不限,数量不限,体重180-220g(购自中国医科大学动物部)。采用腹腔内注射10%的水合氯醛麻醉;胶原酶V原位灌注(1.0 mg/ml、溶于HANKS液)、快速切取、水浴消化(37.5±1℃)11-15分钟,消化液呈乳糜状外观不透明时迅速倒入冷的Hank’s液,加满50ml离心管以终止消化并且轻轻振荡混匀后低温离心一次(800r/min,4℃-8℃,2 min),经80目不锈钢筛网过滤,以去除大快的组织和线结,再次离心(800r/min,4℃-8℃,2 min)。然后采用Ficoll不连续密度梯度离心纯化胰岛。浓度分别为:27%、25%、23%、20.5%和11%。胰岛培养:胰岛分离纯化后悬浮于RPMI-1640培养基中培养(含青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml、10%FCS),培养密度为100IEQ/孔,培养条件为:37℃、5%二氧化碳、95%空气。并且根据实验目的不同分别在培养基中加入20mM的牛磺酸或者0.1mM的RGD肽。胰岛活性鉴定:胰岛培养6小时或1周后,用丫啶橙/溴乙啶(AO/EB)荧光染色观察牛磺酸或者RGD肽对胰岛活性的影响。将AO/EB与胰岛制备物混合孵育10分钟,在荧光显微镜下观察。AO对活细胞染色发出绿色荧光,EB对死细胞染色呈桔黄色荧光。胰岛素分泌功能检测:用Kreb’s-Hank’s液(含有10mmol/L HEPES和0.25%牛血清白蛋白)液洗二次,作胰岛素释放试验。计数20IEQ胰岛,用含低浓度葡萄糖(2.8mmol/L)的Kreb’s-Hank’s液孵育2h,然后用含有高浓度葡萄糖(16.7mmol/L葡萄糖)的Kreb’s-Hank’s液孵育1h,收集第2h和第3h的培养液并去除附着的细胞和碎片,采用放免法检测培养液中胰岛素含量,计算胰岛素释放指数(SI)流式细胞仪检测:caspase-9作为细胞凋亡的标记、磷酸化Akt作为细胞存活的标记,应用流式细胞仪检测三组(RPMI-1640或含有20mM的牛磺酸或者0.1mM的RGD肽)caspase-9和磷酸化Akt阳性细胞比例,观察牛磺酸或RGD肽对caspase-9及Akt的影响。RT-PCR检测胰岛细胞的TNF-α、IL-1β、NF-κB、HO-1、MCP-1、和ICAM-1基因的表达(RPMI-1640或含有20mM的牛磺酸或者0.1mM的RGD肽),β-actin作为内参照。结果采用改良梯度离心法,平均每只大鼠可获得约600-700IEQ胰岛,YO/EB荧光染色,结果显示刚分离后胰岛活率＞95%。单纯用RPMI-1640培养1周后胰岛分泌指数为1.64±0.28,基础培养基中加入牛磺酸或者RGD后胰岛分泌指数为2.45±0.24和2.28±0.16,较对照组明显增加,差异具有显著性,p＜0.05。流式细胞仪检测结果表明胰岛单纯用RPMI-1640培养24小时后,激活的caspase-9为19.66±4.66%,加入RGD后激活的caspase-9为12.14±2.44%,较单纯培养组明显降低8%,并且其差异具有统计学意义,p＜0.05;单纯用RPMI-1640培养1周后激活的caspase-9为41.03±4.46%,加入牛磺酸后激活的caspase-9为23.85±3.09%,较单纯培养组明显降低18%,并且其差异具有统计学意义,p＜0.05;牛磺酸及RGD均能抑制caspase-9激活。因为整合素受体激活后能诱导Akt473位丝氨酸磷酸化,我们检测了RGD对Akt磷酸化的影响,胰岛单纯用RPMI-1640培养24小时后,Akt磷酸化占41.70±3.25%,加入RGD后磷酸化Akt占61.054±6.03%,较对照组明显的升高,其差异具有统计学意义,p＜0.05;1周后单纯用RPMI-1640培养组Akt磷酸化占31.47±4.08%,加入牛磺酸后磷酸化Akt细胞占49.14±6.73%,较对照组明显的升高,其差异具有统计学意义,p＜0.05;结果表明牛磺酸及RGD均能使Akt磷酸化抑制细胞凋亡。RT-PCR检测胰岛TNF-αmRNA、IL-1βmRNA、NF-κBmRNA、HO-1mRNA、MCP-1mRNA和ICAM-1mRNA表达的结果:胰岛分离纯化后在体外经过6小时的孵育有明显的TNF-αmRNA、IL-1βmRNA、NF-κBmRNA、HO-1mRNA和MCP-1mRNA表达,但是随着培养时间的延长(培养72小时、1周)TNF-αmRNA、IL-1βmRNA、NF-κBmRNA、和MCP-1mRNA表达逐渐减弱,其各时间组的差异具有显著性(P＜0.05);HO-1mRNA表达逐渐增强各时间组的差异具有显著性(P＜0.05)。胰岛培养3天时ICAM-1mRNA表达明显,培养1周后表达明显减弱,差异显著(P＜0.05)。培养基中加入牛磺酸后胰岛TNF-αmRNA、IL-1βmRNA、NF-κBmRNA、ICAM-1mRNA和MCP-1mRNA表达明显减弱,在同一时间点和单纯培养组比较差异具有显著性(P＜0.05)。而且随着培养时间的延长减弱的趋势更加明显(P＜0.05)。HO-1mRNA的表达较单纯培养组明显增强且随着时间的延长表达更明显(P＜0.05)。结论胰岛分离纯化过程中各种应激导致TNF-α、IL-1β、NF-κB、MCP-1、ICAM-1的转录增加,诱导胰岛细胞凋亡,影响移植胰岛的活性和功能。胰岛经过短期培养能减弱TNF-α、IL-1β、NF-κB、MCP-1、ICAM-1的表达。牛磺酸能抑制TNF-α、IL-1β、NF-κB转录并活化Akt,抑制细胞凋亡。RGD能和整合素受体结合活化Akt抑制细胞凋亡。