研究背景与目的肝细胞癌是世界上较为常见的恶性肿瘤之一,每年有大约70万例诊断为肝细胞癌的患者,在我国恶性肿瘤死亡分类构成中列第2位。目前的主要治疗手段为肝切除、消融、肝移植、介入和分子靶向治疗,各种治疗方法虽然不断组合与改进,但是患者生存率依然无法显著提高,主要原因还是术后的复发与转移,因此肝细胞癌转移机制的研究成为了目前的焦点之一。肝癌的转移主要是指癌细胞的侵袭和迁移,就分子机制而言,是通过一些重要基因和信号通路的调控来实现的。近年来,Notch信号通路与肝癌转移的关系研究较受关注。研究内容主要包括筛选肝癌细胞中异常表达的Notch通路相关分子,调控Notch通路相关信号分子对癌细胞生物学行为(侵袭、迁移、增殖和凋亡等)的影响,以及肝癌高危因素(肝炎病毒、HBx蛋白等)通过Notch信号通路促进肝癌发生、发展。IL-24能够阻滞肿瘤细胞周期,抑制细胞生长,并诱导细胞凋亡。相关研究表明IL-24基因具有潜在的抗肿瘤性,而且能选择性的杀伤肿瘤细胞,但是对正常的组织细胞却没有影响,这种现象在黑色素瘤细胞、肝癌细胞等肿瘤细胞中都有报道。而且IL-24属于人体自身产生的细胞因子,没有毒性作用,甚至能够提高肿瘤细胞对化疗的敏感性,可以减少化疗的副作用。本课题通过IL-24联合抑制Notch信号通路(Notch通路阻断剂GSI-I、Notchl siRNA)处理肝癌细胞,从侵袭和迁移、增殖、凋亡几个方面探讨应用IL-24和抑制Notch通路所产生的生物学效应以及相关机制。本课题进一步阐明了Notch信号通路在肝细胞癌侵袭、迁移、增殖和凋亡中的作用机制,深入研究了IL-24在这个过程中发挥的协同作用,为肝细胞癌复发转移的治疗提供了一个新的方法。第一部分IL-24联合GSI-I对肝细胞癌侵袭迁移及增殖凋亡的影响研究方法利用γ-分泌酶抑制剂-I(GSM)和IL-24分别以及联合处理肝癌细胞株(SMMC7721、HepG2)。设立GSI-I组、IL-24组、GSI-I/IL-24组和对照组,用Transwell实验检测肝癌细胞侵袭能力,细胞划痕实验检测肝癌细胞的迁移能力,MTT法检测各组肝癌细胞增殖,流式细胞仪及Hoechst染色法检测各组肝癌细胞凋亡情况。Western Blot法检测各组肝癌细胞Notch相关信号通路关键分子,以及上皮间质转化、凋亡相关分子表达水平。结果1.与对照组(Control)比较,GSM单独处理后,侵袭的HepG2细胞数目减少(323.3±25.1 vs 175.0±23.1,P<0.01),差异有统计学意义；IL-24单独处理后侵袭的细胞数目没有显著变化(323.3±25.1 vs 307.3±31.3,P>0.05)；而IL-24和GSI-I联合作用HepG2细胞,发生侵袭的细胞数明显减少(323.3±25.1vs 37.7±31.4,P<0.01)。联合组与GSI-I单独作用组相比也有显著的减少(37.7±31.4 vs 175.0±23.1,P<0.01),与IL-24单独作用组相比同样有明显的减少(37.7±31.4 vs 307.3±31.3,P<0.01)。与对照组(Control比较,GSI-I单独处理后穿透Transwell膜的SMMC7721细胞数目明显减少(266.7±17.8 vs157.7±14.0,P<0.01),差异有统计学意义；IL-24单独处理后穿透Transwell膜的细胞数目没有显著的差异(266.7±17.8 vs 245.67±21.5,P>0.05)；而IL-24和GSI-I联合作用SMMC7721细胞,穿透Transwell膜的细胞数更为明显的减少(266.7±17.8 vs 76.0±22.3,P<0.01),差异有统计学意义。联合组与GSI-I单独作用组相比也有显著的减少(76.0±22.3 vs 157.7±14.0,P<0.01),与IL-24单独作用组相比同样有明显的减少(76.0±22.3 vs 245.67±21.5,P<0.01),说明IL-24和GSI-I联合作用能比GSI-I单独作用组更为明显的抑制肝癌细胞株SMMC7721的侵袭。2.与对照组(Control)比较,GSI-I单独处理后HepG2细胞划痕的愈合率有一定程度的下降(83.6+3.9 vs 66.5±4.9,P<0.01),差异有统计学意义；IL-24单独处理后的愈合率也有下降(83.6+3.9 vs 52.6+3.4,P<0.01)；而IL-24和GSI-I联合作用HepG2细胞,愈合率则有显著下降(83.6±3.9 vs 6.8±1.9,P<0.001)。联合组与GSI-I单独作用组相比也有显著的减少(6.8±1.9 vs66.5±4.9,P<0.001),与IL-24单独作用组相比同样有明显的减少(6.8±1.9vs52.6±3.4,P<0.001)。与对照组(Control)比较,GSI-I单独处理后SMMC7721细胞的愈合率略有下降(56.3±6.8 vs 48.4±7.2,P>0.05),差异无统计学意义；IL-24单独处理后的划痕愈合率也没有显著的差异(56.3±6.8 vs 50.4±5.7,P>0.05)；而IL-24和GSI-I联合作用SMMC7721细胞,细胞愈合率显显的减少(56.3+6.8 vs 25.4±4.0,P<0.001),差异有显著统计学意义。联合组与GSM单独作用组相比也有显著的减少(25.4±4.0 vs 48.4±7.2,P<0.01),与IL-24单独作用组相比同样有明显的减少(25.4±4.0vs 50.4±5.7,P<0.01),说明IL-24和GSI-I联合作用能比GSI-I单独作用组更为明显的抑制肝癌细胞株SMMC7721的迁移。3.低浓度IL-24单独处理HepG2细胞,SNAIL1、SNAIL2的表达略有降低,对E-cadherin蛋白的表达没有显著影响。GSI-I单独处理,抑制Notch1、SNAIL1、 SNAIL2的表达,SNAIL下游E-cadherin的表达也相应的上调了。IL-24和GSI-I联合作用于HepG2细胞,显著抑制了Notch1蛋白的表达,而且也抑制了EMT相关蛋白SNAIL1、SNAIL2的表达,同时发现E-cadherin蛋白表达上调是伴随SNAIL蛋白表达下调发生的。4.浓度2.5μM的GSI-I单独作用时,SMMC7721的平均增殖率较对照组(GSI-I浓度OμM)降低了3.5(P>0.05),而HepG2的细胞平均增殖率则明显下降,降低了65.1(P<0.01)。IL-24和GSI-I联合作用24小时后,SMMC7721表现出了细胞增殖率随着GSI-I浓度的增加而下降的趋势。在50ng/ml的IL-24作用下,GSI-I在2.5μM浓度时,SMMC7721的细胞平均增殖率较对照组降低了35.1(P<0.05)。而对于肝癌细胞株HepG2,IL-24和GSI-I这种抑制肿瘤细胞生长的效应更为明显,细胞平均增殖率低于20%,较对照降低了83.4(P<0.01)。5.经GSI-I单独处理HepG2细胞,较对照组没有发生明显的凋亡。IL-24单独处理HepG2细胞,出现了部分细胞的凋亡,而且以早期凋亡为主。IL-24和GSI-I联合作用HepG2细胞的凋亡率为14.81±1.33,与对照组和单独作用的实验组相比有显著的差异(P<0.01)。经GSI-I单独处理SMMC7721细胞,凋亡率与对照组没有显著差异(P>0.05)。IL-24单独处理HepG2细胞,凋亡率较对照组有升高(P<0.05)。IL-24和GSI-I联合作用组,凋亡率与对照组和GSI-I单独处理组相比皆有显著的增加(P<0.01),与IL-24单独处理组相比也有升高(P<0.05)。结论1.IL-24虽然自身只有较弱的抑制肝癌细胞的迁移的作用,也没有发现抑制侵袭的作用,但是IL-24能够显著增强GSI-I对肝癌侵袭迁移的抑制作用,发挥了协同抑制效应。2.IL-24和GSI-I联合作用抑制肝癌细胞的侵袭迁移,是通过显著上调E-cadherin以及下调MMP-2实现的。3.IL-24和GSI-I联合作用能够显著的抑制肝癌细胞增殖,同时还有下调XIAP,明显诱导肝癌细胞凋亡的作用。4.IL-24和GSI-I联合应用有可能成为肝细胞癌治疗的一个新方法。第二部分IL-24联合siNotchl对肝细胞癌侵袭和凋亡的作用研究方法为进一步确认IL-24和GSI-I是通过Notch通路发挥的作用,我们选择Notch1为作用靶点,设计了该基因的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA),用Notch1的siRNA从基因水平下调Notch1,阻断该信号通路,再次检测对肝癌细胞的侵袭、凋亡以及EMT相关蛋白的表达情况,以及IL-24在该过程中发挥的协同抑制效应。设立siNotch1组、IL-24组、siNotch1/IL-24组和空白对照组,检测各组肝癌细胞株HepG2侵袭和凋亡,Western Blot法检测Notch信号通路关键分子表达,以及EMT相关分子和凋亡相关分子表达水平,用PARP和Caspase3/7检测试剂盒检测HepG2的凋亡。结果1.与对照组(Control)比较,siNotch1单独处理后侵袭的HepG2细胞数目减少(508.7±14.6 vs 196.7±13.9,P<0.01),差异有统计学意义：IL-24单独处理后侵袭的细胞数目没有显著减少(508.7±14.6 vs 496.0±15.4,P>0.05)；而IL-24和siNotch1联合组,发生侵袭的HepG2细胞数明显减少(508.7±±14.6 vs27.7±±7.6,P<0.01)。联合组与siNotch1单独作用组相比也有显著的减少(27.7±7.6 vs 196.7±±13.9,P<0.01),与IL-24单独作用组相比同样有明显的减少(27.7±±7.6 vs 496.0±15.4,P<0.01),说明IL-24和siNotch1联合作用能够比单独作用组更为明显的抑制肝癌细胞株HepG2的侵袭。2.低浓度IL-24单独处理HepG2细胞,SNAIL1、SNAIL2的表达略有降低,对E-cadherin蛋白的表达没有显著影响。siNotch1单独处理,抑制Notch1、SNAIL1、 SNAIL2的表达,SNAIL下游E-cadherin的表达相应的上调。IL-24和siNotch1联合作用于HepG2细胞,由于干扰了Notch1基因的表达而使Notch1蛋白的表达下调,同时发现EMT相关蛋白、SNAIL2表达下调。仔细研究发现,与siNotch1单独作用组比较,SNAIL1下调程度无显著差异,E-cadherin蛋白发生了显著的表达上调。IL-24和siNotchl联合作用通过抑制Notch信号通路(下调Notchl),抑制了EMT的发生,从而抑制肝癌细胞侵袭迁移的过程。该过程的通路和信号分子的变化与IL-24/GSI-I联合作用后的效果较为相似。3.IL-24或siNotchl单独作用组都有Caspase-3/7活性的增强,IL-24/siNotchl联合作用组Caspase-3/7活性较对照组和单独作用组都有显著的增强,联合组的酶活力单位是对照组的约5倍,是单独作用组的约2-3倍。IL-24或siNotch1单独作用都能诱导一定程度的早期凋亡,但是联合作用组的凋亡现象更为显著。结论1.IL-24虽然自身没有抑制肝癌细胞侵袭的作用,但是能够显著增强siNotch1对肝癌侵袭的抑制作用,发挥了协同抑制效应,这种作用是通过显著上调E-cadherin以及下调MMP-2实现的。2.IL-24和siNotchl联合作用有明显的诱导肝癌细胞凋亡的作用。