乙氧氟草醚是美国罗门哈斯公司开发研制的含氟二苯醚类除草剂,主要通过抑制杂草的光合作用来达到除草目的。乙氧氟草醚使用范围广,杀草谱广,持效期长,活性高,可与多种除草剂复配使用,对后茬作物无残留毒害,对人毒性低,但是其对水生无脊椎生物和鱼类高毒的问题日渐引起了人们的重视。目前关于乙氧氟草醚的检测方法仅限于仪器分析方法(如高效液相色谱法,气相色谱法,液质连用检测法等),但仪器检测法有着高成本(仪器费用高)、高污染(有机溶剂使用量大,对环境不友好)、操作程序复杂和难以实现高通量检测等问题,而免疫分析是一种简单、快速、灵敏、低成本、高通量的检测技术,已经成为当前农产品质量安全检测领域的研发热点和发展趋势之一。本论文以含氟二苯醚类除草剂乙氧氟草醚为研究对象,制备其高质量的鼠源单克隆抗体,并以此单克隆抗体建立了间接竞争酶联免疫分析方法(ic-ELISA)、化学方法免疫分析方法(CLEIA),直接竞争和间接竞争时间分辨免疫分析方法(ic-TRFIA anddc-TRFIA)和荧光偏振免疫分析方法(FPIA)。实验结果显示,建立的5种免疫分析方法均可以应用于农产品和环境样品中乙氧氟草醚的快速检测,并且可以为后续乙氧氟草醚残留检测免疫试剂盒和试纸条的开发提供可靠的理论依据和数据支持,还能为农药小分子的快速检测提供全新的研究思路。主要研究内容如下:1、乙氧氟草醚单克隆抗体的制备利用Zn粉和醋酸-盐酸还原法,将乙氧氟草醚分子中的硝基还原为氨基,得到乙氧氟草醚半抗原。采用戊二醛法将乙氧氟草醚半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联制备包被抗原,与牛血清蛋白(BSA)偶联制备免疫抗原。利用合成的免疫抗原分别采用快速佐剂免疫和常规免疫两种方法对BALB/c雌性小白鼠进行免疫,获得免疫小白鼠脾细胞,将脾细胞和Sp2/0骨髓瘤细胞融合,筛选阳性克隆细胞并进行亚克隆。结果表明,常规免疫获得的阳性克隆细胞效价和对乙氧氟草醚的竞争性更强,效果更加理想。选取能够稳定分泌乙氧氟草醚单克隆抗体且灵敏度最高的杂交瘤细胞株(1A7D6F5)为后续实验生产单克隆抗体(McAb)。经检测,所得到的单克隆抗体亚型为IgM;效价为5.73×105。并对所得到的单克隆抗体进行了轻重链的测序。制备得到的单克隆抗体均为高效抗体,可作为建立乙氧氟草醚免疫分析方法的抗体材料。2、乙氧氟草醚酶联免疫吸附分析方法研究利用制备的单克隆抗体建立了乙氧氟草醚ic-ELISA方法,并依次优化了包被抗原、抗体的工作浓度,工作缓冲液的配比条件。在最优条件下建立了乙氧氟草醚酶联免疫吸附分析方法的标准曲线,其抑制中浓度(IC50)为0.065 mg/L,最低检测限(LOD,IC20)为 0.0048 mg/L,线性范围(IC20-IC90)为 0.0048-0.63 mg/L。该方法除与乙羧氟草醚(CR=16.66%)和甲羧除草醚(CR=13.54%)存在一定交叉反应外,与其他乙氧氟草醚结构类似物的交叉反应均小于0.02%。分别在土壤、苹果、桃、梨、葡萄五种基质中添加0.05-0.5 mg/kg的乙氧氟草醚标准溶液,其平均回收率为74.1-107.2%,相对标准偏差为2.7-9.7%。利用GC方法对ic-ELISA方法进行了真实样品检测的验证,两种方法检测结果具有良好的相关性,相关性方程为y=1.0001x+0.0081,R2=0.986,表明本研究建立的ic-ELISA方法检测结果准确、可靠,可应用于环境和农产品中的乙氧氟草醚残留检测。3、乙氧氟草醚化学发光酶联免疫分析方法研究在化学发光体系为免疫反应信号检测模式下,利用制备的单克隆抗体建立了化学发光酶联免疫分析方法(CLEIA),确定了该模式下发射波谱。并对发光时间、抗体的工作浓度和工作缓冲液条件等进行了优化。在最优工作条件下,该方法的IC50为 0.021 mg/L,最低检测限 IC20 为 0.0016 mg/L,线性范围 IC20-IC90 为 0.0016-0.28 mg/L。除与乙羧氟草醚(CR=13.12%)和甲羧除草醚CR=9.52%)存在一定交叉反应外,与其他乙氧氟草醚结构类似物的交叉反应均小于0.02%。分别在土壤、苹果、桃、梨、葡萄五种基质中进行添加回收率试验,平均添加回收率为77.2-106.4%,相对标准偏差为2.4-7.9%。利用GC-ECD对本方法进行了真实样品的相关性检测试验,结果表明,两者的检测结果具有高度相关性,相关性方程为y=0.9239x+0.0119,R2=0.9931,证明本研究建立的CLEIA方法具有较高的可靠性与准确性,可用于环境与农产品中乙氧氟草醚残留的快速检测。4、乙氧氟草醚时间分辨荧光免疫分析方法研究利用镧系元素铕(Eu)的自身荧光特性,与制备的乙氧氟草醚单克隆抗体相结合,建立了直接和间接乙氧氟草醚时间分辨荧光免疫分析方法(dc-TRFIA,ic-TRFIA)。对铕标抗体进行纯化,并对铕标抗体、单克隆抗体的工作浓度和工作缓冲液等条件进行了优化。在最优条件下,dc-TRFIA的IC50为10.27 ng/mL为,最低检测限 IC10 为 0.071 ng/mL,检测范围(IC10-IC90)为 0.071-1074.3 ng/mL,ic-TRFIA的检测范围(IC10-IC90)0.024-504.6 ng/mL,IC50 为 2.76 ng/mL。最低检测限 IC10为0.024 ng/mL,对比可知,ic-TRFIA的灵敏度和检测限均优于dc-TRFIA,因此选取ic-TRFIA进行了后续进一步研究。交叉反应检测显示,除与乙羧氟草醚(CR=11.58%)和甲羧除草醚(CR=8.23%)存在一定交叉反应外,与其他乙氧氟草醚结构类似物的交叉反应均小于0.02%。在五种基质中进行添加回收试验,ic-TRFIA的平均添加回收率为74.6-108.3%,相对标准偏差在2.1-10.9%之间,与GC-ECD进行的真实样品的相关性检测试验结果表明两者具有高度相关性(y=0.975x-0.4446,R2=0.9901),表明本研究建立的TRFIA方法具有较高的可靠性与准确性,可用于环境与农产品中乙氧氟草醚残留的快速检测。5、乙氧氟草醚荧光偏振免疫分析方法研究利用乙氧氟草醚单克隆抗体建立了荧光偏振免疫分析方法(FPIA),并对荧光示踪物、抗体的工作浓度和工作缓冲液条件等进行了优化,确定最优工作条件为pH 7.5,0.4 mol/LNa+含20%甲醇的硼酸盐缓冲液。在最优条件下,根据得到的标准曲线计算线性范围(IC10-IC90)为1.15 ng/mL-312.72 ng/mL,IC50 为 5.71 ng/mL,最低检测限IC10为1.15 ng/mL。建立的FPIA法对乙氧氟草醚具有高特异性,与乙氧氟草醚结构类似物的交叉反应率均小于0.02%(乙羧氟草醚CR=14.57%,甲羧除草醚CR=9.49%)。分别在土、葡萄、梨和桃四种基质中进行了添加回收率试验,平均添加回收率在79.2～107.1%之间,相对标准偏差在2.2～10.3%之间。在检测真实样品中乙氧氟草醚含量时,FPIA法所测结果与GC-ECD的检测结果具有高度相关性,相关性方程为y=0.9113x+0.0611,R2=0.972,证明本研究建立的FPIA方法具有较高的可靠性与准确性,可用于农产品和环境样品中乙氧氟草醚的现场快速检测。