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自噬(Autophagy)是细胞利用自身囊泡吞噬细胞质蛋白或细胞器,然后与细胞内的溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解囊泡所包裹的内容物的过程。LC3蛋白,全称为微管相关蛋白l轻链3(Microtubule—associated protein 1light chain 3),是细胞自噬发生过程中的标志性蛋白。LC3蛋白在细胞内会以两种分子量大小不同的形式存在。其中分子量为18KD是微管相关蛋白1的轻链亚基,称为LC3-I;另一种分子量为16KD蛋白则是自噬体膜的必须组分,称为LC3-II。细胞发生自噬时,其中游离在细胞质中Ⅰ型LC3经泛素样变化会与自噬膜表面的磷脂酞乙醇胺(PE)结合形成II型LC3,细胞中形成的LC3-II蛋白会与自噬体的膜稳定结合,在细胞自噬的整个过程中LC3-I的量都在不断的减少而LC3-II的量却在不断的增加,因此可以用细胞内LC3-II/LC3-I得值来评价自噬的发生过程和程度。本研究采用重组LC3蛋白免疫健康的羊驼,监测血清中抗LC3蛋白抗体效价,采集外周血分离淋巴细胞,提取淋巴细胞内总RNA用于构建噬菌体展示文库。通过液相磁珠方法筛选出抗LC3纳米抗体并构建原核表达载体进行重组表达和活性鉴定,构建真核表达载体转入细胞内实现了首次在胞内用抗体检测自噬发生时的LC3蛋白。主要研究内容和创新点如下:1.采用重组LC3蛋白皮下多点免疫羊驼,ELISA监测血清效价显示在第三次免疫后,有明显效价,采集20 ml第三次免疫后的羊驼血液进行淋巴细胞分离和总RNA提取,经巢式PCR、酶切、电转化,获得库容量为6.8×108的抗LC3纳米抗体基因文库,辅助噬菌体救援后,得到的抗LC3纳米抗体噬菌体展示文库滴度为5.5×1013CFU/mL。2.采用液相磁珠的筛选方法筛选出抗LC3纳米抗体,测序后多序列比对结果表明,获得了3种不同的纳米抗体序列,分别命名为L338、L340和L346。3.构建pET28a-His-L338、pET28a-His-L340、pET28a-His-L346原核表达载体进行表达和纯化,采用ELISA、Western Blot以及Fortebio Octet对L338、L340和L346重组纳米抗体进行活性鉴定和结合力测定,结果显示三个抗LC3纳米抗体都有活性,结合力分别为120 nM、378 nM和313 nM。4.构建pcDNA3.1-mTagRFP-L338真核表达载体,和pcDNA3.1-EGFP-LC3共转染入Hela细胞,加入Rap和CQ分别诱导和抑制细胞自噬,检测抗LC3纳米抗体在真核细胞中的活性,结果显示抗LC3纳米抗体和LC3蛋白有共定位现象,表明L338号抗LC3纳米抗体在真核细胞中有活性,首次实现了在胞内用抗体检测自噬发生时的LC3蛋白。