研究背景： 肿瘤是威胁人类健康的主要疾病，目前化学治疗仍然是中晚期癌症患者的主要治疗手段，但是现有的抗肿瘤药物还不能满足临床治疗的需要。因此，寻找高效、低毒的抗肿瘤药物和辅助药物是一迫切而长期的任务。顺铂(Cisplatin，CDDP)是目前最为有效的抗肿瘤药物之一，属于细胞周期非特异性药物，具有抗瘤谱广、对乏氧肿瘤细胞有效的特点[1]。该药在临床上广泛用于头颈部鳞状细胞癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴肉瘤以及肺癌等恶性肿瘤的治疗，其中对非精原细胞性睾丸瘤最有效，它是多种肿瘤联合化疗方案的主要组成药物。尽管顺铂自上个世纪70年代就开始用于临床治疗恶性肿瘤，但两大因素制约了该药的临床应用。一是肿瘤细胞对顺铂产生耐药性(包括固有性耐药和获得性耐药)，从而导致化疗失败，恶性肿瘤的治愈率和远期生存率受到影响；二是顺铂在长期大剂量使用时可产生比较严重的不良反应，如胃肠道反应、骨髓抑制、耳毒性等。因此，寻找能有效防止肿瘤耐药性产生和增加肿瘤对顺铂的敏感性，以降低顺铂用量、减少不良反应的方法，对提高顺铂的疗效，扩大顺铂的应用范围具有重要的意义。 细胞缝隙连接(gap junction，GJ)是细胞之间的一种蛋白质连接通道，广泛存在于实质性脏器(如心脏，肝脏，肾脏，中枢神经，皮肤，肌肉等)组织中。GJ提供了一种细胞与细胞之间的直接联系通道，是细胞之间信号传递的一种重要方式。现已证明GJ在同步细胞的活动、维持细胞内环境稳定、控制细胞的生长和发育等生命过程中发挥十分重要的作用。研究发现：在多种肿瘤组织和细胞中，GJ的功能降低或缺失；恢复或增强GJ功能，可增强多种抗肿瘤药物(包括顺铂)的细胞毒性[2，3]。因此，寻找能够增强肿瘤细胞GJ功能的药物，将为防止肿瘤对顺铂耐药性的产生，提高顺铂疗效，降低其不良反应提供一种有效的途径。但是至今为止，尚未发现能特异改变GJ功能的药物。 黄连素(berberine)是从毛茛科黄连属植物根状茎中提取的一种异喹啉生物碱，以往研究表明，它有抗原虫和抗微生物的作用，临床上长期用于清热解毒、抗肠道细菌感染[4]。近来的研究发现黄连素有增强肿瘤细胞对某些化疗药物和放疗敏感性的作用。如Myung—Ja YOUN等[5]研究发现，用黄连素预处理HeLa细胞，能够增强顺铂诱导细胞凋亡的作用；J.Liu等发现黄连素能增强雌激素受体抑制剂对乳腺癌细胞系的毒性[6]。但目前黄连素增强化疗药物对肿瘤细胞杀伤力的机理不明。 研究目的： 本研究在转染并稳定表达连接蛋白32和连接蛋白26(connexin32/connexin26，Cx32/Cx26)的HeLa细胞，观察黄连素对顺铂细胞毒性和GJ功能的影响；并探讨黄连素是否可以通过改变GJ功能而增强顺铂细胞毒性。本研究将为阐明黄连素增强顺铂抗肿瘤作用的机理提供新的资料；为寻找更有效的防止肿瘤耐药性产生，提高顺铂疗效的方法提供新的思路。 实验方法： 转染并表达含Cx32/Cx26的HeLa细胞的培养、筛选及诱导：本实验室构建了能够表达异质性Cx32/Cx26通道的载体质粒(PBI—Cx32T/Cx26)[7]。这种双向质粒可以在一个启动子的控制下同时表达Cx32和Cx26。Cx的表达是可以控制的，一般情况下，Cx不表达；需要表达时，在培养基中加入doxycycline引起Cx表达。这样，能够避免因过度表达Cx引起的细胞伤害。本研究采用转染并稳定表达Cx32/Cx26的HeLa细胞。 标准细胞集落形成分析法(Standard colony—forming assay)分析顺铂细胞毒性 本研究采用Dr.Glazer报道的“标准细胞集落形成分析法”，测定顺铂对培养细胞(稳定表达Cx32/Cx26的HeLa细胞)的细胞集落(克隆)形成的影响[2]。细胞集落形成反映了单个细胞增殖潜力，能较灵敏地测定抗癌药的活性。本实验以顺铂降低细胞集落形成率(Surviving Fraction)作为顺铂的细胞毒性指标。用不同密度接种细胞的方法获得有GJ形成(已融合)的细胞和无GJ(未融合)的细胞。在上述细胞，观察GJ形成对顺铂的细胞毒性影响。细胞集落形成率(Surviving Fraction)=顺铂处理组的细胞集落数/未用顺铂处理组的细胞集落数 为了避免不同生长期的细胞对顺铂敏感性的差异对实验结果的影响，细胞在加入顺铂前24小时用无血清培养基培养，使所有细胞均同步在G1期。“Parachute assay”测定细胞之间荧光染料传递－检测黄连素对培养细胞GJ功能的影响[7-9]。将表达有Cx32/Cx26的HeLa细胞与荧光指示剂Calcein—AM和Dil—CM共同孵育，使Calcein—AM和Dil—CM进入细胞。培养4小时，待形成稳定的GJ后，用显微荧光系统观察，计数一个“供体细胞”周围含有Calcein的“接受细胞”作为GJ功能指标。 免疫印迹法(Western blotting)测定黄连素对Cx32/Cx26表达水平的影响：收集每组约5×105个细胞，提取细胞全蛋白，用DC蛋白分析试剂盒(美国Bio—Rad)和分光光度计绘制曲线并测定蛋白浓度。每孔取20μg蛋白，加上样缓冲液在90℃温度下变性5min，80V电泳30min，使蛋白电泳至浓缩胶和分离胶交界处，再用100V电泳1h，使蛋白电泳至分离胶底部，蛋白电泳装置完成10％SDS—PAGE电泳，用蛋白电转移100V350 mA耗时90min将蛋白转移至NC膜上(美国Hybond)。5％脱脂牛奶封闭1h，与抗HA抗体(1:1500)(美国Zymed)、4℃摇床过夜孵育，TBST洗涤10min3次，再与羊抗鼠源IgG(1:15000)孵育1h，TBST洗涤5min3次，用增强型化学发光检测试剂盒(ECL)(英国Amersham Intermational plc)放射自显影于X线胶片上。 实验结果： 1.顺铂(2.5μM)能够显著降低稳定表达有Cx32/Cx26的HeLa细胞集落形成率。在有GJ形成的细胞(高密度接种，生长融合的细胞)，顺铂的细胞毒性显著大于无GJ形成的细胞(低密度接种，细胞生长未融合)。在有GJ形成的细胞，用GJ抑制剂oleamide(25μM)和18-α—GA(10μM)可降低顺铂的细胞毒性；而GJ功能增强剂全反式维甲酸(All—Trans—Retinoic Acid，RA)可显著增加顺铂的细胞毒性。结果表明GJ形成和增强GJ功能可增强顺铂的细胞毒性；抑制GJ功能可降低顺铂的细胞毒性。 2.黄连素增强由Cx32/Cx26组成的GJ功能。“Parachute Assay”荧光传递实验表明：黄连素(0.01-1μM)能浓度依赖性的增加表达Cx32/Cx26的HeLa细胞之间的荧光传递，表明黄连素能显著增强GJ功能。 3.黄连素增强Cx32/Cx26蛋白表达。Western blotting检测的结果表明，黄连素(0.1-1μM)能上调doxcycline诱导的Cx32/Cx26蛋白表达水平。 4.采用Dr.Glazer报道的“标准细胞集落形成分析法”，测定黄连素对培养细胞(稳定表达Cx32/Cx26的HeLa细胞)的细胞集落(克隆)形成的影响。研究结果发现，有无GJ形成的细胞，在黄连素实验浓度范围内(0.001μM-1μM)，对表达Cx32/Cx26的HeLa细胞无毒性作用。 5.在有GJ形成的细胞，用黄连素(0.1μM)显著增强顺铂的细胞毒性。在有GJ形成的细胞，用黄连素(0.1μM)预处理4小时后再用顺铂(5μM)处理1小时，细胞集落形成率显著低于顺铂单用组；而在无GJ形成细胞，黄连素对顺铂的细胞毒性无影响。 结论： 1.GJ形成和GJ功能升高能够显著增强顺铂的细胞毒性；GJ功能减弱可降低顺铂的细胞毒性。 2.黄连素能增加Cx32/Cx26组成的GJ功能；黄连素增强GJ功能的作用与其增加Cx32/Cx26蛋白表达有关。 3.黄连素可通过增加GJ功能而增强顺铂细胞毒性。