柑橘为多年生木本植物,常通过转基因技术验证柑橘基因功能和加速育种进程,但目前柑橘在组织培养遗传转化方面存在操作要求高、操作繁琐、周期长、转化效率低和成年态转化困难等问题。课题组前期研究发现柑橘原始种质枸橼C-05不仅具有独特的抗柑橘溃疡病特性,而且具有优异的再生能力,是开展柑橘遗传转化的理想材料。因此,本研究分别从枸橼C-05茎段扦插、茎段组织培养再生、叶片扦插、农杆菌介导的枸橼C-05茎段扦插遗传转化和农杆菌介导的枸橼C-05茎段组织培养遗传转化5个方面开展了系统研究,取得了以下结果:1.建立了枸橼C-05茎段扦插萌发不定芽的再生体系。根据枝条半木质化和木质化程度的差异,分别取直径3.5 mm以下、3.5～4.5 mm及4.5 mm以上的枝条,将枝条剪为7 cm左右的茎段,在不同温度（22℃、25℃、28℃、32℃、36℃）条件下培养,统计不定芽萌发数,结果显示,选用直径3.5～4.5 mm的枸橼C-05茎段扦插,不定芽萌发比例最高,可达46.2%,平均每根茎段萌发的不定芽数不足1个,且扦插茎段在28℃环境下培养生长最佳。将扦插茎段顶端置于MT（1/4）+6-BA（3 mg/L）溶液浸湿的脱脂棉上保湿,在温度为28℃,光照强度为9000 lux的室内补光人工气候室培养,平均每根茎段顶端萌发的不定芽数量可达2个。2.构建并优化了枸橼C-05成年态茎段的再生体系。通过对枸橼C-05成年态茎段体外消毒方法和再生培养体系进行研究,发现在洁净的植物培养室中生长的枸橼C-05的新梢枝条,经75%酒精消毒30 s,1%次氯酸钠溶液浸泡15 min,消毒效果最佳,愈伤诱导率可达85.2%。而在田间或大棚中培养茎段材料消毒困难。在不添加外源激素的情况下,茎段在MT基础培养基上也能形成不定芽,不定芽萌芽率为33.52%,且不定芽直接扦插在MT培养基上即可快速生根,无需微芽嫁接或使用生根培养基,缩短了获得再生苗的时间。3.确定了枸橼C-05叶片扦插的再生体系。对枸橼C-05不同叶龄和类型（带/不带芽）的叶片在灭菌蛭石上扦插培养,发现均可生根,其中成熟叶扦插的根系发育最佳。带芽的叶片在蛭石中扦插可发育成完整植株;而不带芽叶片尚不能萌发不定芽,有关萌发不定芽的条件正在进一步探索中。初步探索了枸橼C-05成年态茎段组织培养的遗传转化体系和高效的枸橼C-05茎段扦插遗传转化体系。以冰糖橙成年态茎段为对照,通过已确定的枸橼C-05成年态茎段消毒方法,利用农杆菌介导遗传转化,结果显示:在共培养阶段,枸橼C-05茎段培养基中农杆菌增殖速度显著高于冰糖橙,600 mg/L浓度的头孢霉素都难以抑制枸橼C-05转化过程中农杆菌的生长,有关条件有待进一步优化。以本研究确定的萌发不定芽数量最多的枸橼C-05茎段（直径3.5～4.5 mm）为材料,扦插培养,确定了可保持茎段顶端不易干枯死亡的方法:农杆菌重悬液用10%甘油代替蔗糖,将茎段顶端浸泡在重悬液中15 min,再用MT（1/4）+6-BA（3 mg/L）+Hyg（25 mg/L）溶液在茎段顶端保湿,使顶端生成较好的愈伤组织,目前正在对转基因植株进行筛选和鉴定。此方法无需特定的组织培养条件,简单易操作,可开发为高效的柑橘成年态遗传转化途径。