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缺血预适应(IPC)是一种对短暂缺血发作的快速适应性反应,能减少在随后较长缺血期中细胞的损伤。IPC 是一种有效的内源性保护机制,在减少心肌缺血再灌注损伤方面的作用已被较多的研究所证实。但目前 IPC 对体外循环(CPB)中心肌细胞凋亡影响的研究较少,且少见明确的关于其机理的相关报道。近年来研究显示,缺血再灌注损伤与核转录因子-кB(NF-кB)有着密切的关系,NF-кB 是一类氧敏感的核转录因子,它和其抑制蛋白 IкB 结合,以非活性形式存在于胞浆中,在缺血刺激下,结合体解聚,NF-кB 进入细胞核,和多种基因上启动子区的固定核苷酸序列结合,启动基因的转录和表达,这些基因的表达产物可诱导合成调解炎性反应的蛋白质,在心脏缺血再灌注损伤所引起的细胞凋亡及坏死中发挥着关键性作用。基于上述研究背景,本课题在建立稳定的山羊体外循环缺血预适应动物实验模型的基础上,针对细胞凋亡的各种生化特征和时程特点,应用多种方法检测心肌细胞凋亡,以了解 CPB 及缺血再灌注后心肌细胞凋亡的发生规律,并观察 IPC 对 CPB 中心肌细胞凋亡的影响,以及应用 NF-кB 抑制剂ProDTC 对 IPC 在减少心肌细胞凋亡方面保护效应的影响,以探讨 NF-кB 在 IPC 对 CPB中心肌细胞凋亡影响中的作用。主要研究方法和结果如下: 实验动物分为 4 组:组 A:单纯体外循环组(CPB 组)(n=5),仅行并行循环;组 B:单纯缺血再灌注组(IR 组)(n=5),并行循环 45min 后,主动脉阻断(ACC)60min,主动脉开放后恢复灌注(RP),辅助循环 30min 后撤除 CPB,继续观察 60min,间断顺行灌注冷晶体心脏停搏液行心肌保护;组 C:缺血预适应组(IPC 组)(n=5),在缺血再灌注(IR)前行 ACC5min,开放恢复灌注 5min,共 3 轮 IPC;IPC 后心脏适应 15 min 再重复上述 IR 过程。组 D:IPC 加特异性 NF-кB 抑制剂(ProDTC,脯氨酸二硫氨基甲酸酯)组(IPC+ProDTC 组)(n=5):在 IPC 前、中应用 ProDTC(15mg/Kg),余与组 C 相同。本研究分为两个部分:一、 体外循环动物模型的建立、心功能监测及心肌超微结构改变 1、心功能变化 CPB期间组A心率(HR)、平均动脉压(MAP)、左室内压峰值(LVSP)、左室等容收缩期压力升高最大速率(dp/dtmax)、左室舒张期压力下降最大速率本课题受上海市“曙光计划”(02SG30)资助 2<WP=7>第二军医大学 摘 要 硕士学位论文(dp/dtmin)较 CPB 前略下降,但差异不显著(P>0.05)。组 B、组 C 及组 D RP60min时左室 dp/dtmax 和 dp/dtmin 较 CPB 前及组 A 均明显下降(P<0.05),组 C 在 RP 60min与 90min 时左室 dp/dtmax 和 dp/dtmin 均明显高于组 B 及组 D(P<0.05);至 RP 90min时与组 A 无显著差异(P>0.05)。2、心肌组织病理及超微结构改变 HBFP(碱性复红苦味酸染色)染色观察组织病理改变。结果显示:组 A 心肌染色呈阴性;组 B 及组 D 心肌呈现弥漫性阳性着色;组 C 心肌呈局灶性或小片状阳性着色,程度明显轻于组 B 及组 D。 以透射电镜观察心肌超微结构。结果显示:组 A 心肌超微结构仅轻微变化;组 B及组 D 再灌注期间可见明显的心肌细胞损伤;组 C 心肌细胞损伤程度明显轻于组 B 及组 D。 该部分结果提示:IPC 能够减轻 CPB 中心肌细胞的损伤,并有利于再灌注期间心功能的恢复。IPC 前、中给予 NF-кB 抑制剂 ProDTC 可阻断 IPC 的保护效应。二、 NF-кB 对缺血预适应影响心肌细胞凋亡的影响1、心肌细胞凋亡的研究 针对细胞凋亡不同时程的生化特征应用多种方法检测心肌细胞凋亡。 1.1 TUNEL 法原位检测细胞凋亡 使用 TUNEL 试剂盒检测凋亡心肌细胞。结果显示:组 A 未见阳性染色细胞,组 B 及组 D RP90min 时均见较多阳性染色细胞,与组 B及组 D 比较,组 C 阳性率明显低。 1.2 AnnexinV-FITC/PI 双标记检测细胞凋亡 以 AnnexinV 和 PI 标记心肌细胞,以流式细胞仪进行凋亡及坏死细胞定量。结果显示:组 A 于 CPB 末期可检测到少量的坏死细胞及凋亡细胞;组 B 与组 D 于 RP90 min 时,两组均检出较多坏死细胞和凋亡细胞。RP 90min 时,组 C 凋亡细胞和坏死细胞百分率均明显少于组 B 及组 D(P<0.05)。2、NF-кB 核转录活性的研究 2.1 Western-blot 法检测心肌组织 NF-кB 活性 应用 NF-кB P65 抗体标记,免疫印迹法检测 CPB 前、60min ACC 前即时(IPC 后)、ACC 后即时及 RP90min 后心肌中NF-кB 活性。结果显示:CPB 前心肌中未见 NF-кB 显示带。IPC 后,组 C NF-кB 带明显,而组 D 带稀疏,ACC 及再灌注后,组 C NF-кB 活性带较稀疏,组 B 及组 D 带明显,与组 C 有显著差异。 3<WP=8>第二军医大学 摘 要 硕士学位论文 2.2 EMSA(电泳迁移率改变分析)法检测 NF-кB 核结合活性 应用 EMSA 法测CPB 前、ACC 前、ACC 后及 RP90min 后心肌中 NF-кB 核结合活性。结果显示:CPB前心肌中 NF-кB 未见明显激活。IPC 后,组 C NF-кB 活性水平明显升高,而组 D 未见明显激活,活性水平存在显著差异(P<0.05)。ACC 及再灌注后,组 C NF-кB 活性较低,组 B 及组 D 明?