前言缺血性心脏病是世界上发病率及死亡率极高的疾病,严重威胁人类的健康,并耗费巨额卫生资源。缺血导致的心肌细胞缺氧是其主要病理因素。近年来的研究表明缺氧诱导因子-1（Hypoxia indueible factor-1,HIF-1）,是调节缺氧组织氧的需求与供应之间的平衡,维持体内氧环境稳定的主要因子。HIF-1是转录因子,在缺氧情况下,它的表达及活性增加,通过激活一系列靶基因,包括促红细胞生成素（EPO）、血管内皮生长因子（VEGF）、葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）和Bnip3等基因的表达促进氧环境的稳定,促进微循环和侧支循环血管形成,调节葡萄糖,铁和能量代谢,调节血管活性和酸碱平衡,调节细胞存活与凋亡的平衡,从而促进细胞和组织适应低氧环境。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β两个亚单位组成的杂合性二聚体。HIF-1β在细胞中的浓度稳定,而HIF-1α的表达及活性均由氧浓度调节。在正常氧情况下,HIF-1α被脯氨酸羟化酶（PHD1、2、3）羟化。羟化的HIF-1α与VHL（Von-Hippellindou）肿瘤抑制基因编码的VHL蛋白结合。VHL蛋白是E3泛素连接酶复合物的一部分,它介导了HIF-1α的泛素化及其在蛋白酶体中的降解。同时天门冬氨酸羟化酶（FIH）羟化HIF-1α抑制HIF-1α的活性。在缺氧情况下,脯氨酸羟化酶的作用减弱甚至消失,HIF-1α的降解被抑制,使HIF-1α在细胞内快速聚集,转移至细胞核内,与HIF-1β聚合,形成有活性的HIF-1蛋白。同时天门冬氨酸羟化酶的羟化作用减弱,使HIF-1α的活性增加。HIF-1与其靶基因的缺氧反应元件（HRE）5’-RCGTG-3’结合,促进其转录,使细胞及组织适应缺氧的环境。近年来的研究表明,提高HIF-1α在缺血心肌中的表达及活性能明显促进新生血管形成,促进心肌细胞存活,减少缺血再灌注损伤,降低心肌梗塞面积,提高心肌功能。因此,调节HIF-1α的表达及活性成为治疗缺血性心脏病的新的方法。Ⅱ型糖尿病是缺血性心脏病最常见的合并症之一。研究表明,冠心病合并糖尿病或者心肌梗塞后发生应激性高血糖症患者的死亡率明显增高,应用胰岛素可明显降低死亡率。冠心病合并Ⅱ型糖尿病患者心肌内侧支循环明显减少,心肌损伤明显加重,预后差,可能与HIF-1表达减少相关。但目前尚无报道证实糖尿病时HIF-1信号转导系统改变的分子生物学机制以及它们与缺血缺氧后心肌损伤的关系。如何通过调节HIF-1信号转导系统治疗冠心病合并糖尿病有待研究。GK（Goto-kakizaki）糖尿病大鼠是国际上广泛应用的自发性Ⅱ型糖尿病动物模型。它是通过选择性繁殖自发性糖耐量异常的Wistar大鼠得来的多基因型糖尿病模型,具有稳定的高血糖症、高胰岛素血症、胰岛素抵抗、无明显高脂血症及高血压等特点。多个研究表明与健康Wistar大鼠相比,GK大鼠缺血缺氧时心脏损伤重、血流减少、功能差。本研究应用缺氧及高葡萄糖条件下培养的大鼠心肌细胞及制作GK糖尿病大鼠心肌梗塞模型探讨冠心病合并糖尿病时HIF-1的改变及其机制以及与缺血缺氧后心肌损伤和血管形成的关系,阐明冠心病合并糖尿病心脏病变的分子生物学机制,为探讨通过调节HIF-1信号转导系统治疗冠心病合并糖尿病新的方法提供理论基础和科学依据。第一部分高血糖对缺氧及非缺氧条件下培养的乳鼠心肌细胞缺氧诱导因子1α表达的影响及机制探讨目的通过不同浓度的葡萄糖对正常氧浓度及模拟缺氧条件下培养的大鼠心肌细胞缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α）表达的影响,探讨血糖对缺氧状态及非缺氧状态下大鼠心肌细胞HIF-1α的作用及机制。材料与方法体外培养新生大鼠的心肌细胞,给予不同的处理因素培养6小时,具体分组为:①正常对照组（5.5mM葡萄糖）;②氯化钴（Cocl₂）模拟缺氧组（5.5mM葡萄糖+400uM Cocl₂）;③高葡萄糖组（11.1mM、22.2mM、33.3mM葡萄糖）;④氯化钴（模拟缺氧）+高葡萄糖组（11.1mM葡萄糖+400uM Cocl₂,22.2mM葡萄糖+400mM Cocl₂,33.3mM葡萄糖+400uM Cocl₂）;⑤高葡萄糖+抗氧化剂α-tocopherol组（33.3mM葡萄糖+100uMα-tocopheml）:⑥氯化钴（模拟缺氧）+高葡萄糖+抗氧化剂α-tocopherol组（33.3mM葡萄糖+400uM Cocl₂+100uMα-tocopherol）。观察高葡萄糖、氯化钴、高葡萄糖合并氯化钴对HIF-1αmRNA及蛋白表达的影响,以及给予抗氧化剂α-tocopherol阻断氧化作用后,高葡萄糖、高葡萄糖合并氯化钴对HIF-1αmRNA及蛋白表达影响的变化。结果1、与正常对照组相比,氯化钴模拟缺氧后,大鼠心肌细胞HIF-1α的表达增加;2、在非缺氧状态下,随着葡萄糖浓度（5.5mM、11.1mM、22.2mM、33.3mM）的增加HIF-1α的表达逐渐增加;3、氯化钴合并高葡萄糖培养条件下,随着葡萄糖浓度（5.5mM、11.1mM、22.2mM、33.3mM）的增加,大鼠心肌细胞HIF-1α的表达逐渐减弱;4、高葡萄糖合并抗氧化剂α-tocopherol（33.3mMGlu+100uMα-tocopherol）培养条件下,大鼠心肌细胞HIF-1α的表达较单纯高葡萄糖（33.3mMGlu）时减弱;5、氯化钴合并高葡萄糖及抗氧化剂α-tocopherol（33.3mMGlu+400uMCocl₂+100uMα-tocopherol）的培养条件下,HIF-1α的表达较同样氯化钴合并高葡萄糖（33.3mMGlu+400uM Cocl₂）时增加。结论葡萄糖对非缺氧状态下培养的大鼠心肌细胞HIF-1α的作用是增强其表达,而对缺氧状态下培养的大鼠心肌细胞HIF-1α的作用是减弱其表达,其机制可能涉及ROS信号转导系统及氧化应激反应。第二部分慢性氯化钴处理对GK糖尿病大鼠缺氧诱导因子1的表达及心梗面积的影响目的通过制作GK糖尿病大鼠和Wistar非糖尿病大鼠心梗模型,研究氯化钴是否降低GK糖尿病大鼠血糖及心肌梗塞面积,并促进缺血区缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α）的表达。材料与方法1、应用体重在200-250克重的雄性GKⅡ型糖尿病大鼠及其对照雄性Wistar大鼠,通过开胸手术后结扎麻醉大鼠冠状动脉左前降支制作大鼠在体心梗模型,心梗模型制作前测量体重、血糖,手术成功后分组饲养大鼠3周。2、实验分组:Wistar假手术组,Wistar心梗组,Wistar心梗+氯化钴处理组,GK假手术组,GK心梗组,GK心梗+氯化钴处理组,每组动物至少存活6只。Wistar和GK假手术组只挂线不结扎冠状动脉左前降支,Wistar和GK心梗组结扎冠状动脉左前降支,Wistar和GK心梗+氯化钴处理组术前2天开始饮用含1.5mmol/L Cocl₂的水,结扎冠状动脉左前降支后,术后给予饮用含2mmol/L Cocl₂的水,各组均不限制饮食。3周后,测量体重、血糖,剪取心脏。留取标本进行HE染色检测心梗面积、HIF-1α抗体免疫组化染色及HIF-1αRT-PCR检测、Western Blot印迹分析。结果1、GK心梗+氯化钴处理组与GK糖尿病大鼠假手术组及心梗组相比,血糖降低;2、GK心梗+氯化钴处理组与GK糖尿病大鼠心梗组相比,心梗面积减少;3、GK心梗组与Wistar心梗组相比,心梗面积增加;4、GK心梗+氯化钴处理组与GK糖尿病大鼠心梗组相比,缺血区HIF-1α表达增加;5、GK心梗组与Wistar心梗组相比,缺血区HIF-1α表达减少。结论慢性氯化钴处理具有降低糖尿病大鼠血糖作用,降低心梗面积,促进HIF-1α在缺血区的表达,可能是冠心病合并糖尿病的一个新的治疗方法。