论文部分内容阅读
普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)能为栽培稻遗传改良提供重要的抗性等位基因资源。然而其基因组高杂合度限制了其测序准确性及有利基因在抗性分子育种过程中的应用。为此,本文利用两份稳定的普通野生稻自交系S18和11352及其普通野生稻原种S24为材料,一是对其主要农艺性状进行观察,同时对稻瘟病和褐飞虱抗性进行鉴定;二是通过高通量测序技术对其全基因组进行重测序以挖掘抗性基因变异信息。主要研究结果如下:(1)农艺性状调查及抗性鉴定。成熟期农艺性状调查发现,自交系S18与11352在株高、剑叶长、剑叶宽、主穗长、有效穗数、结实率、粒长、粒宽、总粒重和千粒重等性状上差异显著,前者株高和有效穗数分别为60.24cm和15.08个,后者分别为121.15cm和6.65个。稻瘟病抗性鉴定结果表明,S18和11352在参试小种中综合抗性等级分别2.0和2.7,均表现为抗病;褐飞虱抗性鉴定结果显示,S18和11352分别为抗病(3级)和中抗(5级)。(2)基因组重测序数据评估筛选及变异分布。将测序数据进行了质量评估并剔除了低质量的数据,在S24、S18和11352中分别筛选得到的77907543、95453868和75256129条高质量reads比对到了日本晴参考基因组(MSU7.0),分别覆盖了(覆盖深度≥5×)参考基因组的93.57%、92.76%和89.99%,平均覆盖深度分别达到44X、65X和42X。检测了S24、S18与11352全基因组范围内的单核苷酸多态性变异(SNP)、插入缺失(InDel)、结构变异(SV)和拷贝数变异(CNV)四种类型的变异位点:SNP变异位点数量分别为1804889、1349511和1686727,SNP杂合度分别为54.71%、11.64%和11.35%,S18和11352的基因组杂合度得到显著降低;InDel变异位点数量分别为444968、333914和391597,大多数的插入和缺失的长度在1-9bp内,占比均超过90%;SV变异数量分别为6489、9728和7863,涉及的SV变异基因数量为1990、3189和2115,其中分别有66.13%、56.16%和64.82%的变异基因属于转座子;CNV变异数量分别为90、99和109,涉及的CNV变异基因数量为4076、2535和3258,其中分别有58.56%、53.53%和53.13%的CNV变异基因属于转座子。(3)S18和11352抗性基因挖掘。S24、S18和11352的大效应变异基因数量分别为16692、12248和14434。对变异基因进行了GO、COG、KEGG和Pfam注释后,在S18和11352中分别鉴定出194和245个NBS-LRR变异基因,包括6个稻瘟病抗性基因(Pit,Pi9,Pi36,Pi56(t),Pia和Pi5)、2个褐飞虱抗性基因(Bph14和Bph26)、2个抗白叶枯病基因(Xa-1和OsRP1L1)以及1个防卫反应相关基因(NLS1)。另一方面,筛选得到了S18和11352中相同基因型的变异,共得到4583个变异基因,GO富集分析发现,分别共有67个变异基因参与到细胞死亡过程,其中包括一个褐飞虱抗性基因LOC_Os12g37280(Bph26);82个变异基因参与到胁迫响应过程。有58个基因参与到了胁迫响应与细胞死亡两个GO通路当中。(4)候选基因蛋白互作及同源聚类。对候选基因进行蛋白互作网络分析,58个候选基因与8个稻瘟病抗性基因(Pi-d3,Pi5,Pi56(t),Pi9,Pia,Pish,Pit,Pita)和3个褐飞虱抗性基因(Bph14,Bph26,BPH18)存在互作关系。进一步验证了这些变异基因可能与稻瘟病和褐飞虱抗性相关。候选基因及其在S18和11352中同源基因系统发育树及保守序列分析可以将这些基因分为四个组(GroupⅠ、GroupⅡ、GroupⅢ、GroupⅣ),分别含有69、32、67和6个基因,不同组中的基因可能参与不同的功能。CD-search保守结构域分析发现,28个同源基因结构域发生变化,同源基因结构域发生改变后可能形成抗性新等位基因。综上所述,本文通过对野生稻自交系抗性新种质S18和11352进行全基因组重测序,发掘了其基因组遗传变异信息,筛选了一批具有抗性基因潜质的优良变异基因,这些抗性等位基因有望在分子育种和功能基因组学研究中得到应用。