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蛋白质的乙酰化修饰是一类高度保守的可逆的蛋白质翻译后修饰,它广泛发生于生物体的各种生理活动中。越来越多的研究表明,蛋白质的乙酰化能够调控或参与多种生命活动,且在蛋白质功能发生与稳定性上发挥重要作用。在对家蚕血淋巴内的各种营养储藏类蛋白进行了高通量乙酰化鉴定后,发现人类Apolipoprotein蛋白的同源蛋白,家蚕血淋巴内的BmApoLp-Ⅱ蛋白(Bombyx mori Apolipophorin-Ⅱ)具有很高的乙酰化程度。本课题针对乙酰化修饰对BmApoLp-Ⅱ蛋白的稳定性影响及其机制进行了较为系统的研究,以期能够进一步阐释乙酰化修饰可能参与的调控家蚕营养储藏和利用的新机制。首先对BmApoLp-Ⅱ在真核细胞内的表达和乙酰化程度进行鉴定。利用Trizol法从家蚕卵巢上皮细胞(BmN)中获取家蚕的总RNA,逆转录成cDNA,PCR扩增BmApoLp-Ⅱ基因ORF编码区,通过酶切将其连接到真核表达载体pIEX-1-si-GFP上,这种经改造的载体能够同时共表达GFP蛋白和目的蛋白,共表达的GFP蛋白可用来确定转染效率和作为参照蛋白。将构建的重组载体pIEX-1-si-GFP-BmApoLp-Ⅱ转染 BmN 细胞,48h 后,6×His 单抗 Western blotting检测目的蛋白成功表达;同时使用6×His单抗作为特异性抗体,免疫共沉淀(IP)分离BmApoLp-Ⅱ蛋白,再将免疫共沉淀产物以乙酰化单抗进行Western blotting检测,发现BmApoLp-Ⅱ蛋白存在较高的乙酰化修饰。综上所述,我们成功在家蚕BmN细胞中表达BmApoLp-Ⅱ蛋白,同时表达的蛋白存在高度的乙酰化修饰。接着开展了乙酰化水平的变化对BmApoLp-Ⅱ蛋白表达影响的研究。在将pIEX-1-si-GFP-BmApoLp-Ⅱ真核表达质粒转染BmN细胞后,通过去乙酰化酶抑制剂混合物Cocktail以及乙酰化酶抑制剂C646处理,上调和下调BmApoLp-Ⅱ的乙酰化水平。研究发现,和共表达的对照蛋白GFP相比,乙酰化水平的上调提高了细胞中BmApoLp-Ⅱ融合蛋白的表达水平,而下调乙酰化水平可导致BmApoLp-Ⅱ融合蛋白水平明显下降,并且蛋白表达的上升或下降均与所用药物剂量呈正相关;同时我们对BmApoLp-Ⅱ基因进行原核表达,成功制备了BmApoLp-Ⅱ的特异性兔多克隆抗体,利用制备的抗体进行Western blotting检测,结果显示,和过表达的BmApoLp-Ⅱ融合蛋白相似,乙酰化水平的上调和下调同样可导致BmN细胞内源BmApoLp-Ⅱ蛋白的表达上调与下调,进一步验证了乙酰化可以上调BmN细胞中BmApoLp-Ⅱ的蛋白表达与细胞含量。另外,qRT-PCR实验发现,药物处理导致的乙酰化水平变化并不能改变BmApoLp-Ⅱ基因mRNA水平,表明BmApoLp-Ⅱ蛋白在细胞内的表达与含量的变化是由蛋白质翻译后水平上的乙酰化修饰影响的。最后开展乙酰化修饰在翻译后水平上调BmApoLp-Ⅱ蛋白表达的机制研究。利用放线菌酮CHX以及蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,检测提升乙酰化水平后BmApoLp-Ⅱ在BmN细胞内的蛋白稳定性,实验数据表明,使用CHX阻断蛋白质合成,在Cocktail处理上调乙酰化水平后,BmApoLp-Ⅱ蛋白的稳定性明显高于对照组;与之相同,使用MG132处理细胞,阻断由泛素介导的蛋白酶体对蛋白质的降解,Cocktail处理可以进一步提升BmApoLp-Ⅱ蛋白的稳定性和细胞含量,表明乙酰化修饰确实能够使BmApoLp-Ⅱ在细胞内的稳定性得到提升。为了解这种蛋白稳定性提升的分子机制,随后进行了乙酰化修饰与泛素化修饰关系的验证性实验,实验结果表明,在使用Coccktail处理细胞,使BmApoLp-Ⅱ的乙酰化水平得到提升时,其泛素化水平则下降,而通过C646降低BmApoLp-Ⅱ的乙酰化水平时,泛素化水平则上升,这表明BmApoLp-Ⅱ蛋白的乙酰化修饰与泛素化修饰存在竞争关系。综合上述实验结果可知,乙酰化修饰能够提升BmApoLp-Ⅱ蛋白的稳定性和在细胞内的含量,很大可能是通过竞争泛素化修饰结合位点,抑制泛素介导的蛋白酶体降解途径来实现的。在本课题的前期研究中,通过蛋白质组学技术发现在家蚕血淋巴内的营养储藏类蛋白存在高度的乙酰化修饰,这表明家蚕的营养储藏和利用很有可能与营养储藏类蛋白的乙酰化修饰有很大关联。开展本课题的研究,能够为进一步深入阐明乙酰化修饰调控家蚕营养储藏与利用的机制打下基础。