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黑色素瘤（Melanoma）是死亡率较高的恶性肿瘤,在兽医临床上常见于老龄动物,在全球范围内发病率呈逐年上升趋势,其特点是恶性程度高、进展快、易远处转移,是一种对常规治疗药物具有较强抗性,在临床治疗过程中颇为棘手的恶性肿瘤。基因治疗成为研究热点,黑色素瘤作为一种浅表性肿瘤,非常适用于基因治疗的观察和研究。本课题组在前期研究中,选择新城疫病毒（NDV）的血凝素-神经氨酸酶（HN）基因作为黑色素瘤的治疗基因,将小鼠端粒酶逆转录酶（mTERT）启动子、小鼠黑色素瘤酪氨酸酶（Tyr）特异性启动子核心片段以及HN基因与腺病毒骨架进行同源重组,成功构建肿瘤特异性和组织特异性重组腺病毒Ad-mTERTp-mTyrp-HN。试验中利用前期构建的重组腺病毒Ad-mTERTp-Tyrp-HN,经大量扩增和纯化,获得Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-mTyrp-HN、Ad-mTERTp-Tyrp-HN和Ad-GFP的滴度分别为1012.5TCID50/mL、1011.75 TCID50/mL、1012.375 TCID50/mL、1012.8752.875 TCID50/mL和1011.3751.375 TCID50/mL。重组腺病毒Ad-mTERTp-Tyrp-HN体外转染小鼠黑色素瘤B16细胞系,通过观察细胞生长状态和绿色荧光蛋白的表达情况,CCK-8法检测细胞存活率,结果表明,Ad-mTERTp-Tyrp-HN对体外培养的B16细胞的抑瘤作用呈剂量依赖效应和时间依赖效应。通过AO/EB染色、DAPI染色、结晶紫染色,从形态学上明确重组腺病毒抑制肿瘤的方式,结果显示重组腺病毒可不同程度地诱导细胞凋亡。AO/EB染色结果可看到未转染病毒的对照组细胞大多数呈现均匀的绿色（即大多数为正常细胞）,只有少量早期凋亡的细胞呈橘红色;而转染Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-mTyrp-HN、Ad-mTERTp-Tyrp-HN和Ad-GFP的细胞出现CPE。经DAPI染色后,腺病毒感染的4组中清晰可见细胞出现CPE,对照组细胞却是均匀一致的亮蓝色,并没有观察到核碎裂等现象。通过细胞划痕试验、细胞侵袭试验检测重组腺病毒对B16细胞迁移侵袭能力;通过扫描电镜检测细胞凋亡,观察到细胞膜皱缩,胞膜起泡或出“芽”,有众多球状凸起小泡形成,呈泡状、多突状或云团状,形态极不规则,并观察到细胞表面光滑的凹陷孔洞,细胞病变明显。本研究构建了BALB/c小鼠荷B16细胞肿瘤模型,并通过尾静脉注射和瘤内注射两种方式探究Ad-mTERTp-Tyrp-HN对B16的抑制作用。尾静脉注射组虽然不能使肿瘤消除,但却使肿瘤生长缓慢。在尾静脉注射48h后,行冰冻切片,于肿瘤组织处可以观察到明显的绿色荧光;荧光定量PCR结果表明Ad-mTERTp-Tyrp-HN能够成倍的提高caspase-3、p21、p53的mRNA表达量。瘤内注射组显示Ad-mTERTp-Tyrp-HN能延长小鼠黑色素模型的中位生存期,生存期长于顺铂治疗组,未引起明显的肝脏、肾脏、脾脏等组织损伤,体重并未减轻;活体成像结果表明,瘤内注射96h后,重组腺病毒仍然可在肿瘤组织处表达,并见明显分布;冰冻切片结果显示,Ad-mTERTp-Tyrp-HN表达组织的荧光强度高于对照组;通过Western blotting检测,重组腺病毒均上调caspase-3、p21、p53蛋白的表达水平,与荧光定量结果一致;TUNEL试验显示,Ad-mTERTp-Tyrp-HN棕色区域占91%;免疫组化结果显示,实验组的caspase-3、p21、p53蛋白阳性率高于对照组（p<0.05）。静脉注射和瘤内注射实验治疗结果显示,虽然两种不同治疗方案均具有抑制实体肿瘤生长的作用,但瘤内注射Ad-mTERTp-Tyrp-HN的治疗效果更为突出。综上所述,Ad-mTERTp-Tyrp-HN在体内体外均具有抑瘤作用,且具有靶向性,呈现明确的抗肿瘤治疗潜力,有望为黑色素瘤的临床治疗提供有效的治疗策略,为进一步利用重组腺病毒治疗疾病奠定基础。