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核转录因子κB(Nuclear Factor-κB，NF-κB)是一种广泛存在的核转录因子，调节着细胞因子、生长因子、细胞黏附分子基因的表达。近年来，众多实验证实多种疾病如急慢性炎症，特别是呼吸系统急慢性炎症疾病的发生发展都与NF-κB的过度活化相关。因此，抑制病理状态下NF-κB的过度活化，可成为治疗、缓解疾病的有效途径。1999年Lebruska等筛选出长度为90mer左右活性位点为31mer的RNA适体(aptamer)，它可与NF-κB的特异位点结合，抑制NF-κB与相关基因调控区上κB序列的结合，从而抑制或阻碍相关基因的表达。Cassiday等用酵母三杂交的方法证实了此NF-κB RNA aptamer的体内生物学活性。本课题主要涉及NF-κB RNA aptamer cDNA重组腺病毒载体的构建和NF-κB RNA aptamer cDNA重组腺病毒对炎症细胞中炎症介质释放抑制的生物学活性研究。采用腺病毒方法介导NF-κB RNA aptamer在真核细胞内表达及其生物学活性的研究尚未见国内外文献报道，本研究可为临床治疗因NF-κB过度活化引起的疾病提供新的方法。 课题研究的主要内容包括：(1)NF-κB RNA aptamer cDNA的克隆；(2)NF-κB RNA aptamer cDNA重组腺病毒载体的构建；(3)NF-κB RNA aptamer cDNA重组腺病毒的产生；(4)建立炎症细胞模型，测定NF-κB RNA aptamer cDNA重组腺病毒的体外生物学活性。 方法：1．合成6个NF-κB RNA aptamer cDNA寡聚核苷酸片段，用改进的小片段拼接技术连接形成全长NF-κB RNA aptamer cDNA，克隆重组质粒形成pGEM-7Z-aptamer cDNA，PCR扩增引进合适的酶切位点后将目的片段插入穿梭质粒pShuttle-CMV。2．Pme Ⅰ酶切、去磷酸化处理重组穿梭质粒pShuttle-CMV-aptamer cDNA，然后与质粒DNA pAdeasy电穿孔进入大肠杆菌BJ5183同源重组制备重组腺病毒载体pAdeasy-aptamer cDNA。3．Pac Ⅰ酶切重组腺病毒载体pAdeasy-aptamer cDNA DNA获得的腺病毒基因组DNA用脂质体转 万古论上NF—K BRNA巴作0印成惠基伪利合么人体外生功引’他一出染的方式导入HEK293细胞，产生复制缺陷型重组腺病毒Ad－aPtamer．。4．选择人前单核细胞U937细胞为靶细胞，用I。PS刺激的方式造成细胞炎症模型。以两种方式测定重组腺病毒Ad飞ptamer的体外生物学活性：＊）直接测定法：质粒DNAPNF K B1UC转染 U937细胞，经重组腺病毒预处理后用 LPS刺激造成炎症模型，然后用测定炎症细胞内报告基因表达产物荧光素酶活性的方法直接观察重组腺病毒产生的 NF－。B RNA aptamer对细胞内 NF。B活性的影响。（2）间接测定法：LPS刺激经重组腺病毒预处理的U937细胞，ELISA测定细胞上清液中山炎症细胞释放的细胞团于IL－lp、IL－6的含量变化。 结果与讨论：且．重组质粒听 信7Z－aPtame，cmA和 pshut tie一规卜aptamercDNA经双酶切和 DNA序歹测定鉴定证实，被克隆的 NF。B RNA apia。er cDNA片段序列正确并且以正确方向插入穿梭载体。2．经Pac酶切和 DNA序列分析证实，穿梭质粒 DNA pshuttle－CMV－aptame，cDNA与 pAdeasy质粒加A在大肠杆菌BJ5183 中成功发生同源重组，产生重组腺病毒载体 pAdeasy－aptamer cDNA。3．重组腺病毒载体转染HEK293细胞（腺病毒包装细胞）7～10天后可见细胞变圆、肿胀，呈葡萄串状、并有少量浮起等病变现象（CPE）。此时收集细胞重急于 PBS中，经三次反复冻融获得的上清中含有大量重组腺病毒颗粒。4．重组腺病毒的鉴定：①NF－。B RNA apia。er cDNA重组腺病毒基因组DNA为模板的 PCR产物具有预期的分于量大小，提示重组腺病毒基因组DNA具有NF－。B RNA aptame，cDNA序列；②提取重组腺病毒Ad－aptame，感染的U937细胞总RNA进行RT－PCR，结果提示，该重组腺病毒感染后的宿主细胞具有NF－。B RNA aPt删 cDNA对应的mRNA表达：③TCID。；；法测定重组腺病毒 Ad－aptame，的滴度为 2 X 10”pfu／。1。5．重组腺病毒Ad－apt。iner体外生物学活性。5．重组腺病毒Ad－aplamer体外生物学活性。直接法测定发现：①LPS处理组的荧光素酶活性是ined urn（仅加培养基）处理组的7倍，Ad－aptame，＋LPS处理组的荧光素酶活性是M－aptame，＋medium处理组的 1．5倩，说明 LPS刺激U937细胞可激活NF－K B的活性，造成炎症细胞模型；②LPS处理组的荧光素酶活性是Adaptamer＋LPS处理组的1．l倍，提示Ad飞Ptamer可抑制炎症细胞内 NF－。B活性，进而降低荧光素酶报告基因的表达。间接法测定发现：①LPS处理组细胞上清液中见一lp和 IL－6含量非常显著高于medium处理组（P（．01），Ad－aPtamer＋LPS处理组和 Ad－CMV＋LPS处理组分别和常 2 尔士伦支 NF—K B RNA区体重用晚离丞历爿台西奥体外生为引c讨对成显著局于 ＊－aptamer＋medium 处理组（P（．01）和 Ad－CMV＋medium 处理组（P＜0．of），表示LPS 处理U937 细胞可以造成体外炎症细胞系模型：②Ad－aptame，＋LPS 处理组细胞上清液中 IL－l日和 IL－6 含量一「常?