论文部分内容阅读
基因的表达过程受到多方面的调控,内源基因编码的非编码单链micro RNA(mi RNA)在动植物中的调控作用的重要性已经被广泛认识。本课题组在前期工作中,采用高丰度的cre-MIR1162 MI0006223作为内源性mi RNA1166.1的表达骨架,成功构建人工mi RNA1166.1序列,转入莱茵衣藻细胞并筛选获得高产氢衣藻转化子。在此基础上,本研究对高产氢衣藻转化子中内源性mi RNA1166.1的靶基因进行预测,探究其功能并构建了一个用于验证mi RNA的靶基因的荧光素酶报告载体。具体结果如下:1.利用WMD3网站预测莱茵衣藻内源性mi RNA1166.1的靶基因,筛选了12个可靠性最高的预测靶基因;2.利用q RT-PCR技术验证高产氢衣藻转化子T-mi RNA1166.1-1、T-mi RNA1166.1-2中mi RNA1166.1的表达量,与野生型对照组相比,衣藻转化子mi RNA1166.1的表达量平均为对照组的5倍以上;3.利用q RT-PCR技术检测12个预测靶基因的基因表达量,其中Cre11.g472700,Cre22.g763650,Cre09.g407501靶基因的基因表达量均呈显著性下调趋势:转化子T-mi RNA1166.1-1的Cre11.g472700,Cre22.g763650,Cre09.g407501靶基因相对表达量分别为0.310、0.373、0.476,基因表达量显著性低于野生型对照组;转化子T-mi RNA1166.1-2的Cre11.g472700,Cre22.g763650,Cre09.g407501靶基因相对表达量分别为0.262、0.500、0.684,基因表达量亦为显著性低于野生型对照组;相对于野生型对照组,Cre17.g696700,Cre03.g189000靶基因相对表达量均为上调;Cre03.g169150,Cre01.g064550靶基因相对表达量均无显著性差异;Cre03.g151000,Cre13.g571400靶基因相对表达量在两个转化子中均呈现出不同的趋势;4.成功构建了p DL-8×靶基因的荧光素酶报告载体,该载体由莱茵衣藻组成型高表达的Psa D基因5’端和3’端片段、Luc基因、Cre05.g238140靶基因的8×靶序列组成,通过“珠磨法”对莱茵衣藻进行遗传转化;5.利用q RT-PCR技术检测7个转化子T-p DL-8×target的Luc基因的基因表达量,与野生型对照组相比,7个转化子均呈现出Luc报告基因被显著性沉默的现象;6.检测7个转化子T-p DL-8×target的Luc酶的化学发光信号,与野生型对照组相比,7个转化子均呈现出化学发光显著性减弱的现象,结果与上述Luc基因表达量一致。综上所述,本研究探索了一种莱茵衣藻内源性micro RNA靶基因的筛选、验证方法,利用q RT-PCR和荧光素酶报告载体相结合的技术,初步验证了莱茵衣藻mi RNA1166.1的靶基因,为单细胞真核绿藻的非编码RNA的功能与靶基因生物学预测开辟了新方向。