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为了研究免疫性不育的相关机制,本课题小组在前期工作中应用免疫共沉淀结合液相色谱串联质谱技术,筛选与不育相关的精子膜蛋白,通过生物信息软件对其进行分析,筛选出15种与不育相关的精子膜蛋白。我们对其中一种蛋白:载脂蛋白A1(Apolipoprotein A1,APOA1)进行分析,研究其在精子中的定位及相关功能。收集来自中国人民解放军总医院健康查体男性精液标本26例。采用PCR技术和免疫印迹技术从分子和蛋白水平检测APOA1的存在,并采用免疫荧光共聚焦显微镜观察APOA1在人精子中的定位。设空白对照组、兔多克隆抗体IgG组和10、20和40μg/ml的APOA1抗体处理精液标本,37℃温箱孵育精子1、2和3 h后,通过精液分析仪观察精子前向运动变化,AnnexinⅤ检测精子的凋亡率和JC法检测精子线粒体膜电位变化。40μg/ml的IgG抗体和APOA1抗体分别孵育小鼠精子1h后,进行小鼠体外受精实验,观察两组受精率的差异。收集不同活力的精液标本83例,采用流式细胞仪分析精子中APOA1含量百分比,统计学软件分析其与精子活力的相关性。精子中存在APOA1的mRNA,其扩增片段大小为190bp。APOA1蛋白也表达在精子细胞中,相对分子质量大小为31kD。免疫荧光共聚焦显微镜显示APOA1蛋白位于精子头部顶体后部和精子的颈部。精子前向运动在APOA1抗体孵育1、2和3 h后显著下降,空白对照组与APOA1抗体浓度20μg/ml组和40μg/ml组间差异有统计学意义,孵育1h后空白对照组(68.65±15.7)%与APOA1抗体浓度20μg/ml组(48.45±5.2)%和40μg/ml组(39.25±7.89)%,t=2.442和3.345,P<0.05。孵育2 h后空白对照组(55.33±10.12)%与APOA1抗体浓度20μg/ml组(28.68±11.7)%和40μg/ml组(18.13±10.52)%,t=3.445和5.097,P<0.05。孵育3 h后空白对照组(35.73±14.08)%与APOA1抗体浓度20μg/ml组(15.53±8.42)%和APOA1抗体浓度40μg/ml组(9.98±7.08)%,t=2.462和3.268,P<0.05)。进一步分析2h不动精子百分比:空白对照组(32.15±8.67)%与APOA1抗体浓度20μg/ml组(57.85±11.93)%和40μg/ml组(68.15±13.92)%,t=3.485和4.390,P<0.05。APOA1抗体孵育精子2h后,随着其浓度的增加精子凋亡率逐渐增加,空白对照组(16.02±4.28)%与抗体浓度20μg/ml组(21.72±2.67)%和40μg/ml组(28.01±3.93)%间有显著的统计学差异(t=3.177和5.834,P<0.01)。精子线粒体膜电位,在APOA1抗体处理精子2h后,空白对照组线粒体膜电位降低的精子百分比(21.53±2.47)%与APOA1抗体浓度为20μg/ml组(33.13±5.48)%、40μg/ml组(36.36±5.35)%间分别具有统计学差异(t=3.34和4.355,P<0.05)。小鼠体外受精IgG组受精率为81%,APOA1抗体处理组为35%,差异具有显著统计学意义,χ~2=48.664,p<0.001。APOA1阳性精子细胞百分比与精子前向运动呈正相关,r=0.427(p<0.01),与不动精子的百分比呈负相关,r=-0.504(p<0.01)。弱精症患者中APOA1阳性精子细胞百分比较正常精子活力者低,弱精症患者为(57.74±11.43)%,正常活力组为(66.54±12.96)%,两组之间具有显著统计学差异(t=2.812,p<0.01)。我们证实精子中存在APOA1蛋白和mRNA,使用APOA1抗体作用于精子后,出现前向运动下降、不动精子百分比增加,凋亡率增加、线粒体膜电位下降、小鼠体外受精率降低,因此APOA1蛋白在维持精子活力中发挥一定作用。精子APOA1蛋白含量与精子活力呈正相关,与不动精子呈负相关,并在弱精症患者精子表达量低,因此可作为评价精子质量的潜在指标之一。