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目的进一步系统观察氧化苦参碱(OMT)对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的保护作用,并探讨其保护作用与Wnt/β-Catenin信号通路的关系。方法1.观察OMT对新生大鼠HIBD的保护作用整体水平:构建七日龄新生大鼠HIBD模型,随机分为假手术组(Sham)、模型组(HI)、HI+OMT(120mg/kg)组。观察OMT对新生大鼠HIBD的保护作用:(1)激光散斑成像观察脑血流情况;(2)ELISA测定血清中S-100B蛋白含量。细胞水平:建立新生大鼠原代海马神经元氧糖剥夺(OGD)损伤模型,随机分为正常组(Control)、模型组(OGD)以及OGD+OMT(18.9μM)干预组。观察OMT对新生大鼠原代海马神经元OGD损伤的保护作用:(1)采用MTT法检测细胞存活率;(2)化学发光法检测线粒体膜电位(MMP)水平;(3)单细胞凝胶电泳实验评价原代海马神经元DNA损伤程度。2.探讨OMT对新生大鼠HIBD的保护作用与Wnt/β-Catenin信号通路的关系整体水平:复制新生大鼠HIBD动物模型,随机分为Sham组、HI组、HI+OMT(120 mg/kg)组及工具药组(XAV-939),造模48h后观察以下指标,(1)TTC染色检测脑梗死体积;(2)HE染色观察脑组织形态学变化;(3)TUNEL染色观察脑组织神经元凋亡程度;(4)免疫荧光检测β-Catenin表达;(5)Western blot检测Wnt1、Dvl2、DKK1、Axin1、APC、GSK-3β/p-GSK-3β、β-Catenin蛋白的表达水平;(6)凝胶迁移实验检测β-Catenin蛋白与Tcf-4的结合活性。细胞水平:复制新生大鼠原代海马神经元OGD损伤模型,分别给予OMT和XAV-939干预24h后:(1)采用q-PCR检测Wnt1、β-Catenin的m RNA相对表达量;(2)Western blot检测c-β-Catenin、n-β-Catenin、Tcf-4、Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白表达水平。结果1.OMT对新生大鼠HIBD的保护作用与Sham组相比,HI组新生大鼠缺血侧大脑脑血流显著降低(P<0.01),血清中S-100B蛋白含量明显增加(P<0.01);与HI组相比,OMT(120 mg/kg)干预后新生大鼠缺血侧大脑脑血流明显增加(P<0.01),血清中S-100B蛋白含量显著下降(P<0.01)。与Control组相比,OGD损伤模型组中海马神经元细胞存活率显著下降(P<0.01),线粒体膜电位降低(P<0.01),且细胞DNA损伤严重(P<0.01);与OGD组相比,给予OMT(18.9μM)干预后细胞存活率及神经元线粒体膜电位明显增加(均P<0.01),细胞DNA损伤程度明显减轻(P<0.01)。2.OMT对新生大鼠HIBD保护作用的相关作用机制与Sham组相比,HI组新生大鼠脑梗死体积显著增加(P<0.01),脑组织病理损伤严重,TUNEL阳性细胞数明显增加(P<0.01),DKK1、Axin1、APC及GSK-3β蛋白表达水平明显增加(P<0.01),Wnt1、Dvl2、p-GSK-3β及β-Catenin表达量显著减少(P<0.01),β-Catenin蛋白与Tcf-4结合活性降低;与HI模型组相比,OMT组新生大鼠脑梗死体积显著降低(P<0.01),脑组织病理损伤明显改善,TUNEL阳性细胞减少(P<0.01),DKK1、Axin1、APC及GSK-3β蛋白表达水平明显降低(P<0.01),Wnt1、Dvl2、p-GSK-3β及β-Catenin蛋白表达量显著增加(P<0.01),且β-Catenin蛋白与Tcf-4结合活性增高。给予抑制剂XAV-939处理后,可削弱OMT对上述指标的调节作用。与Control组相比,OGD组原代海马神经元中Wnt1及β-Catenin m RNA水平明显降低(P<0.01),且细胞核β-Catenin蛋白表达也显著减少(P<0.01),神经元细胞中Tcf-4及Bcl-2蛋白显著下调(P<0.01),促凋亡蛋白Bax、cleaved-Caspase-3及cleaved-Caspase-9蛋白水平显著升高(P<0.01);与OGD组相比,OMT(18.9μM)干预后Wnt1及β-Catenin m RNA水平明显增加(P<0.01),细胞核β-Catenin蛋白水平升高(P<0.05),Tcf-4及Bcl-2蛋白表达量增加(P<0.01),且Bax、cleaved-Caspase-3及cleaved-Caspase-9蛋白表达明显下调(P<0.01)。抑制剂XAV-939干预后可部分抵消OMT的调节作用。结论1.进一步证实了氧化苦参碱对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤具有保护作用。2.氧化苦参碱对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用与激活海马神经元中Wnt/β-Catenin信号通路有关。