论文部分内容阅读
内脂素(Visfatin)是一种新型脂肪细胞因子,与机体炎症和免疫应答反应密切相关。断奶仔猪免疫应激是影响仔猪生产性能的重要原因之一,其主要的病理变化是炎症反应,但最终导致仔猪生长的受阻,给畜牧业生产造成巨大经济损失。本实验室前期研究表明,在脂多糖(LPS)诱导的断奶仔猪免疫应激动物模型中,脾脏白髓和红髓中的内脂素阳性表达产物显著增多,推测内脂素作为炎性介质可能参与了断奶仔猪免疫应激炎症反应的发生和发展。为了获得大量内毒素含量低、并具有生物活性的猪内脂素重组蛋白,并明确其在断奶仔猪免疫应激反应中的作用。本研究首先利用原核表达,蛋白质纯化,生物活性验证,Western Blot,q RT-PCR和ELISA技术制备猪内脂素重组蛋白。然后在利用LPS诱导成功构建的断奶仔猪免疫应激模型基础上,通过q RT-PCR,ELISA,免疫组织和TUNNEL法研究内脂素在断奶仔猪免疫炎症反应中的作用。具体研究结果如下:1猪内脂素重组蛋白的原核表达及纯化条件优化以猪肝脏组织总RNA为模板,利用PCR技术,扩增猪内脂素基因,转入p EASY-T1载体后,再转化Trans5α。进行质粒提取,并与p ET-28a和p ET-30a同时进行Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切;将胶回收得到的Visfatin目的基因片段分别连接到p ET-28a和p ET-30a载体上,转化DH5α,对含有目的基因的表达载体进行克隆;提取重组表达质粒分别转入大肠杆菌Trans BL21和Transetta,经IPTG诱导表达、蛋白经纯化系统AKTAprime10纯化后,采用SDS-PAGE和Western Blot技术进行检测。结果表明,Visfatin-p ET28a-Transetta在16℃诱导16h条件下,能稳定表达出大量高纯度的猪重组内脂素蛋白,为最优表达菌株。2猪内脂素重组蛋白中内毒素去除及检测各国对生物制品的内毒素含量都有严格的要求,为保证生物制品使用的安全性,必须加以去除。本试验选用内毒素去除试剂进行猪内脂素重组蛋白中内毒素的去除,并使用内毒素检测鲎试剂盒检测去除效果。结果表明,去除内毒素后的猪内脂素重组蛋白残余量低于1EU/m L,在安全范围内,防止了其可能对后续试验结果判断产生的影响。3猪内脂素重组蛋白生物活性验证将去除内毒素后的猪内脂素重组蛋白作用于Raw264.7细胞。CCK-8结果显示,随着内脂素浓度的增加,细胞存活率先升高后降低,均高于阴性对照组,当浓度为700 ng/m L时,细胞存活率最高,且差异极显著(p?0.0001),提示内脂素具有促进Raw264.7细胞存活的作用。随后分别设置PBS组、Visfatin组和Visfatin+Poly.B组,并与细胞共孵育6h。q RT-PCR和ELISA结果显示,与PBS组相比,Visfatin组炎症因子IL-1β、TNF-α和MCP-1的m RNA和蛋白表达水平均差异极显著上调;而Visfatin+Poly.B组与Visfatin组相比,炎症因子的m RNA和蛋白表达水平却均没有明显差异。上述结果表明,猪内脂素重组蛋白促进Raw264.7细胞的炎症活动,而残留的内毒素不起作用,证明猪内脂素重组蛋白具有生物学活性。4猪内脂素重组蛋白对断奶仔猪炎症因子表达的影响利用LPS诱导构建断奶仔猪免疫应激模型,测定每头猪的体重及脾脏重量,并计算脾脏指数(脾脏重量(g)/体重(kg)),结果显示:与PBS组相比,LPS组脾脏重量和脾脏指数明显上升,且均差异极显著(p?0.001),Visfatin组的则无显著变化;而LPS+Visfatin组脾脏重量和脾脏指数与LPS组的相比,明显降低,且均差异极显著(p?0.01)。采用q RT-PCR和ELISA技术检测各组脾脏组织中炎症因子IL-1β、IL-6和MCP-1表达变化,结果显示,与PBS组相比,Visfatin组IL-1β、IL-6和MCP-1的m RNA和蛋白表达水平均没有明显差异,而LPS组的却均显著升高。与LPS组相比,LPS+Visfatin组IL-1β、IL-6和MCP-1的m RNA和蛋白表达水平均显著降低。以上结果表明:LPS激活脾脏免疫系统,诱使淋巴细胞合成大量的炎性细胞因子,致使脾脏功能亢进肿大,而内脂素能通过下调炎症因子的表达,降低LPS引起的脾脏组织炎性损伤。5猪内脂素重组蛋白对断奶仔猪抗氧化功能的影响采用ELISA检测各组猪外周血清中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、溶菌酶(LZM)和超氧化物歧化酶(SOD)的表达量变化。结果显示:与PBS组相比,Visfatin组的MDA表达量无显著差异,GSH-Px和SOD均明显升高,而LPS组的MDA的表达量却明显升高,且差异极显著(p?0.01),但GSH-Px无明显变化,而SOD和LZM均明显升高。LPS+Visfatin组与LPS组相比,MDA的表达量明显降低,且差异显著(p?0.05),GSH-Px、SOD和LZM均显著升高。结果表明,内脂素通过提升机体的抗氧化功能,降低断奶应激对仔猪造成的氧化损伤;LPS刺激后,机体发生了严重的氧化损伤,外源性注射内脂素降低了血清中MDA的含量,提高SOD、GSH-Px和LZM的酶活性,证明内脂素通过提升断奶仔猪的抗氧化功能降低免疫应激对机体造成的损伤。6猪内脂素重组蛋白对断奶仔猪外周免疫器官细胞增殖和凋亡的影响采用免疫组化、TUNEL技术以及Leica Image Scope软件,研究并统计分析了不同组脾脏和肠系膜淋巴结组织内细胞的增殖和凋亡。免疫组化法检测增殖细胞核抗原(PCNA)结果显示:增殖细胞阳性信号PCNA主要分布于脾脏和肠系膜淋巴结组织内的生发中心;与PBS组相比,Visfatin组脾脏和肠系膜淋巴结组织内PCNA阳性率均显著升高,而LPS组的却均差异极显著降低;与LPS组相比,LPS+Visfatin组脾脏和肠系膜淋巴结组织内PCNA阳性率均明显升高,且差异均极显著(p<0.01)。TUNEL检测结果显示:与PBS组相比,Visfatin组脾脏和肠系膜淋巴结组织内凋亡细胞阳性率均有降低的趋势;与LPS组相比,LPS+Visfatin组脾脏和肠系膜淋巴结组织内凋亡细胞阳性率均差异均极显著降低。此外,利用q RT-PCR技术检测脾脏组织内细胞凋亡的相关基因,结果显示:与PBS组相比,LPS组的FAS和caspase-3表达均明显上调,且差异极显著(p<0.0001),Visfatin组caspase-3呈下降趋势。而与LPS组相比,LPS+Visfatin组FAS和caspase-3表达则均差异极显著降低。上述结果表明,内脂素通过促进外周免疫器官脾脏和肠系膜淋巴结组织细胞增殖、抑制的细胞凋亡,改善断奶应激仔猪的免疫机能;LPS激活了线粒体凋亡途径,从而抑制了细胞增殖,促使脾脏和肠系膜淋巴结发生凋亡损伤。而外源性注射内脂素通过抑制LPS刺激诱导的外周免疫器官细胞凋亡、促进外周免疫器官细胞增殖、降低FAS和caspase-3的表达,改善机体发生免疫应激时的免疫状况。