研究背景:当人类和其他哺乳动物失去身体部位时,其再生能力有限。相比之下,两栖类生物蝾螈的再生能力很强,甚至在成年时,也能自动再生出失去的肢体。因为蝾螈的四肢在解剖学上与人类的四肢相似,了解它们如何再生,将为再生医学提供重要线索。有研究证实,在肢体再生的整个过程中,炎症可能影响伤口愈合和再生的开始与完成。巨噬细胞作为促炎和抗炎信号的重要来源,在美西螈肢体再生的早期扮演着关键的角色,但是美西螈巨噬细胞在再生中的作用还需深入研究。本研究制备并鉴定了美西螈巨噬细胞表面标志CD14单克隆抗体,为美西螈巨噬细胞分离和功能研究提供了重要的手段。方法及结果:本研究建立美西螈断肢再生模型,并克隆出CD14基因,表达出CD14重组蛋白,成功制备抗蝾螈CD14的单克隆抗体,并用美西螈巨噬细胞验证了该抗体的特异性。1.美西螈断肢再生模型的建立与CD14转录表达。对美西螈截肢,选择7个时间点,观察再生情况,并在每个时间点取样。提取美西螈再生对应时间点的总RNA,反转成c DNA,用美西螈CD14引物,通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）,观察到肢体再生的3dpa时CD14转录水平最高。用石蜡包埋组织样品,切片后经HE染色和Masson染色、观察到7dpa长出芽基,30dpa开始分化出肘关节和四趾,42dpa（day post amputation）趾和肘关节分化完全。2.CD14基因的克隆与鉴定。本研究设计出带酶切位点的CD14引物,经PCR技术扩增出带有酶切位点的CD14序列,长度为296bp,通过双酶切后,连接至原核表达载体p ET28a-sumo上,并转化至克隆菌E.coli DH5α中,测序显示成功构建出原核表达载体p ET28a-sumo-CD14。3.CD14蛋白的表达与纯化。将重组质粒转化至表达菌E.coli BL21（DE3）中,利用IPTG法成功诱导出含sumo标签的CD14重组蛋白,大小约22k D,且该蛋白经Western Blot验证无误。先后通过镍柱纯化,超滤管截流除杂后,经SDS-PAGE验证蛋白纯度较高。4.CD14单克隆抗体的制备及鉴定。用弗氏佐剂乳化该CD14抗原,先后在0周,4周,7周时免疫小鼠3次后,抽取小鼠尾静脉血液,用分离出的血清,经间接ELISA法检测抗体效价水平高于1:106。融合前3d对小鼠腹腔注射抗原进行加强免疫,选取效价最高的小鼠,脱颈处死,制备免疫脾细胞,利用聚乙二醇（PEG4500）融合脾细胞和SP2/0细胞,在含有饲养细胞的RPMI-1640培养液中培养24h后,先后通过HAT培养液和三次亚克隆筛选,最后能稳定并持续分泌CD14抗体的杂交瘤细胞株被成功获得。经Western Blot验证,该CD14抗体与抗原结合的特异性良好。5.美西螈巨噬细胞的获取及鉴定。将RPMI-1640培养基注入美西螈腹腔,轻柔后吸取其腹水,经RPMI-1640培养液洗涤后,将沉淀用加入双抗和血清的RPMI-1640培养液重悬细胞培养。静置培养1天后,显微镜下到观察巨噬细胞形态,并用电镜拍摄照片。经Western Blot、免疫细胞化学、流式细胞术等,确证CD14单克隆抗体能够与美西螈巨噬细胞结合。结论:本研究成功制备出美西螈巨噬细胞表面标志CD14单克隆抗体,且抗体能与美西螈巨噬细胞结合,这为巨噬细胞在美西螈肢体再生中的影响研究提供了基础。