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【研究目的】1.探索口腔鳞癌外泌体在NF向CAF转化中是否具有促进作用;2.筛选口腔鳞癌外泌体中可能促进NF向CAF转化的miRNA;3.初步探讨miR-141-3p对NF向CAF转化的促进作用及其机制。【研究方法】1.提取口腔鳞癌细胞系CAL-27、HSC-3、SCC-4及人口腔粘膜正常上皮细胞系HGEC培养上清内外泌体,并采用透射电镜、粒径分析、WB进行鉴定;收集口腔鳞癌的肿瘤组织及癌旁正常组织,分别提取CAF及NF,采用免疫荧光染色、q PCR、WB进行鉴定;以CAF为对照,将梯度蛋白浓度肿瘤外泌体作用于对应NF,WB检测NF蛋白表达改变情况。2.将CAL-27、HSC-3、SCC-4及HGEC外泌体进行miRNA高通量测序,并结合数据库对结果进行分析,筛选得到可能促进NF向CAF转化的miR-141-3p及靶基因PTEN。3.以miR-141-3p的模拟物(mimics)、抑制剂(inhibitor)及空白对照(NC)转染NF,免疫荧光染色、q PCR、WB检测NF表型及形态改变。划痕实验、transwell细胞迁移实验验证miR-141-3p对NF细胞增殖活性、迁移性能等的影响;WB验证miR-141-3p通过抑制PTEN促进CAF的形成。【实验结果】1.通过差速超速离心分离得到了纯度较高的外泌体,透射电镜观察其形态,呈近似卵圆形,有明显的膜包被;粒径分析测得所提外泌体直径约为100nm;WB检测外泌体标志蛋白TSG101、CD9呈强阳性。2.提取成对原代CAF及NF,利用免疫荧光染色标记α-SMA,可观察到CAF中α-SMA的表达明显强于NF,且CAF细胞体积更大,形态多变,胞体突起更多。利用q-PCR及WB检测α-SMA、FAP-α等CAF标志物的表达情况,发现CAF中表达均高于NF。3.以CAF作为对照,将肿瘤外泌体按照0、5、10、20mg/ml的梯度蛋白浓度作用于NF,WB检测CAF标志蛋白的表达情况,发现随着肿瘤外泌体浓度增加,FAP-α的表达也明显增加。该结果表明:肿瘤外泌体具有促进NF向CAF转化的作用,且与浓度呈正相关。4.将HSC-3、CAL-27、SCC-4及HGEC外泌体进行了高通量测序,对结果进行生物信息学分析,筛选出可能参与促进NF向CAF转化的miR-141-3p及靶基因PTEN。5.将miR-141-3p的模拟物(mimics)、抑制物(inhibitor)及对应空白对照(negative control,NC)瞬时转染NF,培养后分别进行免疫荧光染色、q-PCR、WB、划痕实验、transwell迁移实验,发现mimics作用后,NF增殖性能明显提高,表型发生改变,FAP-α、α-SMA、PDGFR-β转录及蛋白水平均有明显提高。免疫荧光染色显示细胞形态更近似于CAF,胞体增大,突起增多;划痕实验及transwell迁移实验结果表明细胞活动性及迁移性增加。通过WB验证,证实NF中该基因在miR-141-3p作用下被抑制而参与了CAF活化。【结论】口腔鳞癌肿瘤细胞外泌体miR-141-3p进入NF后,通过靶向抑制PTEN,最终引起PDGFR-β的高表达,促进CAF的形成。