【背景】血管生成是肿瘤发展过程中的重要条件之一,肿瘤组织微血管生成的进程、性质和密度直接关系到肿瘤生长、侵袭、转移的能力及预后,肿瘤血管诊断与治疗逐渐成为研究热点。然而,有关的肿瘤血管检测手段和治疗药物尚不令人满意,这主要与缺乏肿瘤血管特异性靶向分子及相关技术手段的不足有关。研究表明,肿瘤血管具有分子异质性,鉴定这些异质性分子并研究其作用,检测其表达水平并动态监测其变化规律,有可能为肿瘤血管靶向性诊断与治疗提供特异性靶向分子。目前肿瘤血管生成的评价主要靠免疫组化染色进行MVD计数,难以从功能上评价血管生成活性,而近年发展的分子成像技术有望实现肿瘤血管生成的可视化定量检测及动态实时追踪。受体靶向性核素内放射治疗与肿瘤血管抑制治疗相结合的肿瘤血管放射受体治疗,成为近年研究的一个热点,有望解决肿瘤血管抑制治疗中的一些问题。分子成像技术及放射受体治疗均有赖于高亲和力的特异性靶向分子。前期工作中,我们通过噬菌体随机肽库筛选获得胃癌血管内皮细胞特异结合肽GEBP11,并对其结合活性进行了初步鉴定。【目的】1、进一步深入鉴定该短肽与胃癌血管内皮细胞的结合特性及其体内胃癌血管靶向性;2、利用该短肽制备同位素探针,进行荷人胃癌裸鼠SPECT成像规律及受体放射治疗的初步研究;3、明确GEBP11短肽对胃癌血管生成的影响,并初步探讨其作用机制。【方法】1、通过蓝色噬斑形成实验及GEBP11、IN11噬菌体在荷瘤裸鼠体内的竞争抑制实验检测噬菌体体内归巢的特异性;2、免疫荧光技术检测GEBP11在荷瘤裸鼠体内的结合特异性;3、免疫细胞化学或荧光检测GEBP11在Co-HUVECs中的定位及内化;4、免疫组织荧光检测GEBP11在人胃癌组织中的结合特异性;5、采用直接法⁹⁹Tc^mO₄^-标记GEBP11,采用NBS法¹³¹I标记GEBP11,纸层析法测定标记率、放射化学纯度等;6、放射自显影鉴定GEBP11同位素探针的结合活性;7、受体放射配基结合分析实验鉴定受体亲和力及受体细胞密度;8、同位素示踪技术检测¹³¹I-GEBP11在荷瘤裸鼠体内的生物学分布;9、SPECT成像技术进行荷人胃癌裸鼠体内⁹⁹Tc^m-GEBP11显像;10、MTT细胞增殖实验、荷瘤鼠抑瘤实验评价¹³¹I-GEBP11对内皮细胞及荷瘤鼠肿瘤的抑制能力;11、免疫组织化学染色计数瘤组织MVD;12、病理学HE染色、血液血细胞分析及生化指标检测观察肝脏损伤及骨髓抑制情况;13、Matrigel管状结构形成实验、鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制实验、小鼠体内Matrigel Plug诱导血管生成实验分析GEBP11对血管生成的影响;14、MTT细胞增殖实验、细胞周期及凋亡分析、细胞侵袭迁移实验、细胞粘附实验探讨GEBP11抑制血管生成的细胞机制;15、基因表达谱芯片技术筛选GEBP11短肽作用Co-HUVECs后的差异表达基因。【结果】1、GEBP11体内胃癌血管靶向性及其结合特性的进一步鉴定IN11噬菌体在肿瘤组织回收的滴度显著高于对照噬菌体或其在对照组织中回收的滴度,而对照噬菌体在各组织之间的差别不大。GEBP11短肽对IN11噬菌体向荷瘤鼠肿瘤组织的归巢具有抑制作用,并且,随着GEBP11短肽浓度的升高,移植瘤内的归巢噬菌体数量逐渐下降,抑制率逐渐增高。荷瘤鼠体内荧光共定位分析显示,肿瘤组织中GEBP11短肽与抗Ⅷ因子抗体分布一致,而对照肽或在心脏、肌肉等对照组织无明显着色。免疫细胞化学或荧光染色显示,GEBP11短肽在Co-HUVECs胞膜及核周胞浆着色,而在HUVECs、GES细胞、胃癌SGC7901细胞及AGS细胞上呈阴性或弱阳性反应。激光共聚焦免疫荧光染色结果显示,4℃孵育时GEBP11主要结合于内皮细胞胞膜,给予内化条件37℃孵育后,结合于胞膜受体的GEBP11短肽可被内化入胞内。免疫组织荧光染色结果显示,GEBP11短肽在人胃癌组织上与CD31抗体着色位置一致,而对照肽URP无阳性反应,慢性胃炎组织上亦未见明显着色。2、GEBP11核素探针在荷人胃癌裸鼠体内的SPECT成像直接法将⁹⁹Tc^mO₄^-标记于GEBP11,纸层析法测定其标记率达90-98%,比活度大于100Ci /mmol,⁹⁹Tc^m-GEBP11在体内外具有良好的稳定性。NBS法将¹³¹I标记于GEBP11,纸层析法测定其标记率达90%,比活度大于10Ci /mmol,具有良好的稳定性。放射自显影结果显示,⁹⁹Tc^m-GEBP11及¹³¹I-GEBP11与Co-HUVECs的结合明显强于HUVECs,而对照标记肽⁹⁹Tc^m-URP或¹³¹I-OXT在Co-HUVECs上无明显结合。受体放射配基结合分析实验结果显示,相同⁹⁹Tc^m-GEBP11标记肽浓度时,Co-HUVECs与标记肽的结合量高于HUVECs,均呈饱和曲线。Scatchard作图示GEBP11与Co-HUVECs、HUVECs的Kd值分别为1.972nM、2.489nM,两种细胞受体密度分别为5.7×105/细胞、3.3×105/细胞。放射性同位素示踪技术检测¹³¹I-GEBP11在荷瘤裸鼠体内的生物学分布结果显示,¹³¹I-GEBP11注入体内2小时后,肿瘤内放射活性高出大多数器官,随时间的延迟,肿瘤内放射性活性下降相对较慢,致使它与其它非肿瘤器官的相对比值逐渐增高,最高比值可达15以上。¹³¹I-GEBP11在体内多数器官清除较快,肾脏内放射性最高,清除时间长。SPECT成像结果显示,⁹⁹Tc^m-GEBP11在体内相对聚集于肿瘤部位,随时间延长渐强,T/NT逐渐增高,12h后开始高于心血池本底,18-24h肿瘤灶显示更加清晰,是比较理想的显像时段。⁹⁹Tc^m-URP对照组SPECT显像无肿瘤部位放射性浓聚现象。3、¹³¹I-GEBP11对荷人胃癌裸鼠移植瘤的抗肿瘤效应体外细胞杀伤实验显示,¹³¹I-GEBP11对内皮细胞增殖有抑制作用,呈浓度依赖性;Na¹³¹I对内皮细胞无特异性杀伤作用;GEBP11浓度达10μg/ml时开始表现出对内皮细胞增殖的抑制作用。抑瘤实验结果显示,eADM肿瘤抑制率最高,为64.9%,¹³¹I-GEBP11次之,为56.3%,Na¹³¹I、GEBP11无明显抑瘤作用。¹³¹I-GEBP11、eADM及GEBP11组可明显延长生存期。¹³¹I-GEBP11治疗组伴有血小板降低、肝功损伤等副反应,但明显轻于表阿霉素。免疫组化染色计数MVD显示,与NS组对照,¹³¹I-GEBP11、GEBP11肿瘤组织MVD计数明显降低。4、GEBP11短肽抑制血管生成的作用及机制Matrigel管状结构形成实验、鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制实验、小鼠体内Matrigel Plug诱导血管生成实验结果显示,GEBP11能抑制内皮细胞的管状结构形成能力、抑制CAM及小鼠体内血管生成。MTT细胞增殖实验、细胞周期及凋亡分析、细胞侵袭迁移实验、细胞粘附实验显示,GEBP11短肽对Co-HUVECs及HUVECs的增殖表现出不同程度的抑制作用,对Co-HUVECs抑制作用更强,GEBP11能诱导内皮细胞的凋亡,而对细胞周期无明显影响。GEBP11对内皮细胞的基质降解和迁移有抑制作用,对内皮细胞的粘附也有抑制作用。采用Trizol法抽提细胞总RNA,经鉴定RNA质量合格。经探针标记、芯片杂交、染色及图像采集等实验步骤,结果显示芯片的杂交信号强度较高,pm_mean（探针信号均值）大于200,neg_control_mean（阴性对照均值）小于10（图44）,共有30000以上个杂交点。表达差异2倍以上定为差异表达基因,分析发现,与Co-HUVECs相比,GEBP11处理后的Co-HUVECs中上调表达的基因有2104个,下调表达的基因有1202个;与HUVECs相比,Co-HUVECs中上调表达的基因有194个,下调表达的基因有579个。【结论】1、GEBP11具有活体内胃癌血管靶向结合的能力,它与胃癌血管内皮细胞膜受体特异结合后可被内化。2、⁹⁹Tc^m-GEBP11 SPECT成像能较好地显示体内肿瘤灶,¹³¹I-GEBP11具有明显的抗肿瘤效应及较弱的毒副作用,为开发肿瘤血管成像核素探针及受体放射治疗新药奠定了基础。3、GEBP11具有抑制胃癌血管生成的作用,这可能通过抑制ECs增殖、基质降解及迁移、粘附能力实现。GEBP11作用于内皮细胞可引起多种基因表达变化,这为探讨GEBP11抑制血管生成的分子机制提供了重要线索。