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第一部分 tTG评估乳腺癌新辅助化疗疗效的临床意义研究目的:探讨tTG评估新辅助化疗疗效的临床意义,从临床水平为乳腺癌肿瘤耐药提供新的理论依据。研究方法:（1）回顾性收集滨州医学院附属医院从2014年1月-2019年6月间病理科存档的接受新辅助化疗的女性单侧乳腺癌病人71例,记录完善的临床病理资料;（2）利用免疫组织化学检测新辅助化疗前后乳腺癌组织中tTG蛋白表达的变化;（3）分别根据RECIST1.1、Miller-Payne分级标准对新辅助化疗疗效进行临床评估和病理学评估,依据评估结果将病人分为:新辅助化疗敏感组和新辅助化疗耐药组,分别统计分析新辅助化疗前后tTG的表达与新辅助化疗疗效、新辅助化疗后耐药组tTG的表达与应用的化疗药物以及新辅助化疗前后tTG的表达与乳腺癌临床病理参数的相关性。研究结果:（1）新辅助化疗后乳腺癌组织中tTG的表达较新辅助化疗前乳腺癌组织中tTG的表达升高;（2）新辅助化疗前tTG的表达水平与新辅助化疗疗效的临床评估和病理学评估均无明显相关性,而新辅助化疗后tTG的表达升高,与新辅助化疗疗效临床评估和病理学评估均有相关性,差异具有统计学意义（p<0.05）;（3）新辅助化疗后耐药组中tTG的表达与应用的化疗药物之间差异无统计学意义;（4）新辅助化疗前乳腺癌组织中tTG的表达与淋巴结转移、Ki67增殖指数有明显相关性（p<0.05）,而与年龄、月经、肿瘤直径、临床分期、组织学分级以及ER、PR、Her-2的表达无明显相关性;新辅助化疗后tTG的表达与肿瘤直径、临床分期以及淋巴结转移有明显相关性,而与年龄、月经、组织学分级以及ER、PR、Her-2、Ki67增殖指数无相关性。研究结论:（1）新辅助化疗前tTG的表达与新辅助化疗疗效临床评估和病理学评估无明显相关性,说明tTG可能不是预测新辅助化疗疗效的一个有效因子;（2）新辅助化疗后tTG的表达升高,并与新辅助化疗疗效临床评估和病理学评估均具有相关性,说明tTG参与了乳腺癌新辅助化疗的耐药,新辅助化疗后tTG的表达升高可能是后续新辅助化疗疗效评估的一个重要因素;（3）新辅助化疗后tTG的表达与应用的化疗药物无相关性,说明tTG参与乳腺癌新辅助化疗耐药的过程,与应用的化疗药物无关;（4）tTG可能在促进乳腺癌的细胞增殖与肿瘤转移中发挥了重要的作用。创新点:经过文献复习与检索,关于tTG评估乳腺癌新辅助化疗疗效的临床意义的研究未见有报道。由于新辅助化疗可以预估肿瘤对药物的敏感性,从新辅助化疗的角度出发,研究tTG乳腺癌新辅助化疗疗效的临床意义可以为乳腺癌肿瘤耐药提供更可靠的理论依据。第二部分tTG介导乳腺癌细胞MCF-7对阿霉素耐药机制的研究研究目的:探讨tTG介导乳腺癌细胞MCF-7对阿霉素耐药可能的作用机制,为解决乳腺癌肿瘤耐药问题提供新的理论依据。研究方法:（1）设计小干扰RNA序列,利用荧光显微镜观察绿色转染蛋白的转染率,采用RT-PCR和western-blot筛选基因沉默TGM2（tTG的编码基因）的最佳序列。（2）将细胞分为 MCF-7、MCF-7/ADR、MCF-7+tTG siRNA 三组,tTG、P-gp、MRP、LRP的mRNA的表达水平通过RT-PCR检测,tTG、P-gp、MRP、LRP的蛋白表达水平通过 western-blot 检测。（3）MTT 法检测 MCF-7、MCF-7/ADR 的 IC50,确定作用于MCF-7/ADR阿霉素合适的浓度。（4）将细胞分为MCF-7、MCF/ADR、MCF-7/ADR+tTG siRNA、MCF-7/ADR+阿霉素、MCF-7/ADR+tTG siRNA+阿霉素五组,对乳腺癌细胞的生物学特性进行测定,细胞生长情况通过MTT法检测,细胞凋亡情况通过流式细胞术检测。研究结果:（1）荧光显微镜下显示绿色转染蛋白转染率达到90%以上,且RT-PCR和western-blot结果显示,siRNA 3序列是基因沉默TGM2的最佳序列。（2）tTG的mRNA和蛋白表达水平分别通过RT-PCR和western-blot检测,结果显示,与MCF-7相比,MCF-7/ADR的tTG的mRNA和蛋白表达水平明显升高,基因沉默TGM2后,tTG的mRNA和蛋白表达水平明显下降,说明转染成功。（3）RT-PCR和western-blot分别检测P-gp、MRP、LRP的mRNA和蛋白表达水平,结果显示,与MCF-7相比,MCF-7/ADR的P-gp、MRP、LRP的mRNA和蛋白表达水平明显升高,基因沉默TGM2后,P-gp、MRP、LRP的mRNA和蛋白表达水平明显下降。（4）MTT法确定 MCF-7 和 MCF-7/ADR 的 IC50 分别为 2.43ug/ml、89.44ug/ml。（5）MTT 测定细胞的生长情况,结果显示,MCF-7与MCF-7/ADR的细胞生长抑制率最低,MCF-7/ADR+tTG siRNA+阿霉素细胞生长抑制率最高。与MCF-7/ADR组相比,MCF-7/ADR+tTG siRNA组细胞生长抑制率明显升高（p<0.05）,并且呈现时间依赖性;与MCF-7/ADR+阿霉素组相比,MCF-7/ADR+tTG siRNA+阿霉素组生长抑制率升高（p<0.05）。（6）细胞凋亡检测结果显示细胞凋亡率最高的为MCF-7/ADR+tTG siRNA+阿霉素组,明显高于 MCF-7/ADR+阿霉素组（p<0.05）。与 MCF-7/ADR 相比,MCF-7/ADR+tTG siRNA 组细胞凋亡率升高（p<0.05）。研究结论:（1）tTG与P-gp、MRP、LRP在MCF-7/ADR中高表达,说明tTG与P-gp、MRP、LRP参与了 MCF-7对阿霉素耐药的过程。（2）基因沉默TGM2后,MCF-7/ADR的P-gp、MRP、LRP mRNA和蛋白表达水平下降,说明tTG可能通过调控P-gp、MRP、LRP的表达介导MCF-7对阿霉素的耐药。（3）基因沉默TGM2后,细胞生长受到抑制,细胞凋亡率升高,基因沉默TGM2联合阿霉素组的细胞生长抑制率和细胞凋亡率最高,说明基因沉默TGM2联合阿霉素可以抑制细胞生长,促进MCF-7/ADR细胞凋亡,使MCF-7/ADR对阿霉素的化疗敏感性增强。创新点:耐药蛋白是肿瘤耐药的主要机制之一,本部分研究从耐药蛋白的角度出发,研究了 tTG可能通过调控P-gp、MRP、LRP介导乳腺癌细胞的肿瘤耐药,既往复习文献和检索,发现关于tTG与P-gp在肿瘤领域的个别研究,尚未见关于tTG与MRP、LRP方面的相关研究。第三部分基因沉默TGM2抑制MCF-7/ADR细胞裸鼠移植瘤生长的研究研究目的:从动物水平,进一步探讨基因沉默TGM2对MCF-7/ADR细胞裸鼠移植瘤的影响。研究方法:（1）MCF-7/ADR注射于裸鼠腋窝脂肪垫,建立裸鼠移植瘤动物模型;（2）根据是否注射基因沉默TGM2载体和阿霉素,将裸鼠分为五组:空白对照组、ADR组、ADR+tTG siRNA组、ADR+阿霉素组、ADR+tTG siRNA组+阿霉素组,按照分组给予瘤体内注射基因沉默载体和阿霉素进行干预;（3）28天后动物处死,肿瘤称重,并行免疫组化检测瘤内tTG、P-gp、MRP、LRP的蛋白表达。研究结果:（1）与ADR组相比,ADR+tTG siRNA组肿瘤抑制作用更明显（p<0.05）;与ADR+阿霉素相比,ADR+tTG siRNA+阿霉素组肿瘤抑制作用更明显（p<0.05）;其中ADR+tTG siRNA+阿霉素组肿瘤抑制作用最明显。（2）与ADR组相比,ADR+tTGsiRNA组tTG、P-gp、MRP、LRP的蛋白表达水平下降,差异具有统计学意义;与ADR+阿霉素相比,ADR+tTG siRNA+阿霉素组的tTG、P-gp、MRP、LRP蛋白表达的水平下降,差异具有统计学意义。研究结论:基因沉默TGM2联合阿霉素可以明显抑制裸鼠移植瘤生长,其机制可能与基因沉默后tTG、P-gp、MRP、LRP蛋白表达的水平下降有关,与体外实验结果一致。创新点:本部分从动物水平进一步探讨了基因沉默TGM2抑制MCF-7/ADR细胞裸鼠移植瘤生长的作用。第四部分MCF-7/ADR外泌体传递tTG参与MCF-7耐药的研究研究目的:探讨MCF-7/ADR通过外泌体传递tTG介导MCF-7对阿霉素耐药的形成。研究方法:（1）利用低温梯度离心法进行外泌体的提取与纯化;（2）采用透射电镜观察外泌体的大小与形态;（3）外泌体的特异性标志物CD63、TSG101的表达及其阴性对照Calnexin的表达通过western-blot方法检测以鉴定外泌体;（4）流式细胞术检测EXO/S、EXO/ADR中tTG的表达水平;（5）利用PKH67标记的外泌体EXO/ADR,倒置荧光显微镜观察细胞对外泌体的摄取情况;（6）western-blot检测tTG 蛋白在 MCF-7、MCF-7/ADR、MCF-7+EXO/ADR 中的表达水平;（7）CCK8法检测MCF-7、MCF-7/ADR、与EXO/ADR共培养的MCF-7对阿霉素的IC50,评估EXO/ADR与MCF-7共培养后细胞对阿霉素的药物敏感性。研究结果:（1）透视电镜观察到外泌体透视电镜观察到外泌体直径介于30-150nm之间,呈典型的圆形或杯口状形态;（2）外泌体的鉴定:western-blot结果显示,Exo/S、Exo/ADR表达外泌体的特异性标志物CD63、TSG101,而阴性对照Calnexin不表达;（3）EXO/S与EXO/ADR中tTG的表达水平:流式细胞术结果显示,EXO/S与EXO/ADR中都有tTG的表达,但与EXO/S相比,EXO/ADR中tTG的表达升高（p<0.05）;（4）倒置荧光显微镜观察到标记PKH67的外泌体与MCF-7共培养 12h 后,MCF-7 摄取率>90%;（5）MCF-7、MCF-7/ADR、MCF-7+EXO/ADR中tTG的表达:western-blot结果显示,与MCF-7相比,与EXO/ADR共培养的MCF-7 tTG 表达水平升高（p<0.05）;（6）MCF-7、MCF-7/ADR、MCF-7+EXO/ADR对阿霉素的药物敏感性:CCK8结果显示,与EXO/ADR共培养的MCF-7对阿霉素的 IC50 为 6.16±1.15,MCF-7 对阿霉素的 IC50 是 1.91±0.18,与 EXO/ADR 共培养的MCF-7对阿霉素的IC50是MCF-7对阿霉素IC50的3.23倍。研究结论:（1）耐药细胞株MCF-7/ADR和敏感细胞株MCF-7均可以分泌外泌体。（2）耐药细胞株MCF-7/ADR和敏感细胞株MCF-7的外泌体中都有tTG蛋白表达,且MCF-7/ADR外泌体的tTG表达水平更高。（3）MCF-7/ADR可以通过外泌体传递tTG,被敏感细胞MCF-7摄取。（4）MCF-7/ADR可能通过外泌体传递tTG介导MCF-7对阿霉素的耐药。创新点:经过复习文献及检索,未见有乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR外泌体传递tTG介导MCF-7对阿霉素耐药的相关研究,本部分研究第一次发现了 MCF-7/ADR通过外泌体传递tTG介导MCF-7对阿霉素的耐药。