第一章脂质PLGA杂合泡的制备及表征[目 的]制备一种具有良好声学响应的超声造影剂——脂质PLGA杂合泡,通过超声靶向微泡爆破向神经系统递送药物。[方 法]采用复乳溶剂挥发和冷冻干燥相结合的技术,以高分子聚合物PLGA为成膜材料,加以脂质修饰,制得脂质PLGA杂合泡。TEM和SEM观察其形貌结构,马尔文粒径仪分析其粒径分布和分散性,超声小动物成像仪检测其成像能力。[结 果]TEM和SEM观察脂质PLGA杂合泡形貌规整,马尔文粒径仪检测显示其平均粒径为852.8± 153.6nm,分散系数为0.32,并且在体内具有稳定且持续时间约0.5h的的超声成像能力,具备一般造影剂的特性并且具有独特的优异性。[结 论]本研究成功制备了一种超声造影剂脂质PLGA杂合泡,具有形貌规整、粒径均一和分散系数好以及超声成像较好的特点。第二章聚焦超声联合微泡对体外血脑屏障模型功能的影响[目 的]建立一种稳定的聚焦超声联合微泡介导体外血脑屏障模型开放的药物递送系统。[方 法]将小鼠脑微血管内皮细胞与脑微血管周细胞、星形胶质细胞通过transwell小室共培养建立体外血脑屏障模型,通过跨内皮电阻值(transendothelial electrical resistance,TEER)和荧光素钠渗透率评价其屏障功能。模型建成后,分为0.4、0.6和0.8Mpa组和对照组,运用不同参数聚焦超声联合微泡辐照transwell小室,分别于超声联合微泡辐照后的0.5、4、12和24h观察BBB的TEER变化以筛选合适的超声参数。确定合适的参数后,观察超声辐照BBB模型后0.5、4、12和24h盐酸阿霉素和FITC-Avidin渗透率的动态变化。[结 果](1)三种细胞共培养6天TEER可达到253.1±10.86Ω/cm2,荧光素钠通透系数为3.490±0.4646×10-6cm/min,模型建立成功;(2)与对照组相比,0.4Mpa组的TEER在24h内差异无统计学意义(P>0.05),0.6Mpa组和0.8Mpa组的TEER 在 0.5h 最小(P<0.05),4、12 和 24h 时 BBB 的 TEER 逐渐变大,0.6Mpa组在24h时基本恢复正常(P>0.05),而0.8Mpa组在24h时未能恢复正常(P<0.05)。(3)0.6Mpa的聚焦超声均能使DOX和FITC-Avidin渗过率增加(P<0.05),而且在24h时都基本能恢复到正常水平(P>0.05)。[结 论]聚焦超声联合微泡可以安全可逆地增加不同分子量物质的BBB模型递送效率。第三章超声联合载荧光探针微泡实时监测血脑屏障开放引发的凋亡事件[目 的]制备一种能开放血脑屏障同时能检测凋亡和抗凋亡的载药和荧光探针的脂质PLGA杂合泡。[方 法](1)通过生物素-亲和素系统设计合成靶向探针Annexin V-Avidin-ICG-BSA(AAIB)和非靶向探针 Avidin-ICG-BSA(AIB),马尔文粒径仪、透射电镜和荧光分度计分别检测其粒径、形貌以及荧光强度,并检测双氧水建立的凋亡模型。(2)采用复乳溶剂挥发和冷冻干燥相结合的技术制备载AAIB和AIB脂质PLGA杂合泡,马尔文粒径仪、透射电镜和扫描电镜、IVIS小动物成像仪器分别检测其粒径、形貌以及荧光成像;激光共聚焦检测其载荧光探针定位情况;SDA-PAGE电泳分析其的成分和负载率随投入量的变化情况;小动物超声成像仪下检测其超声靶向微泡破坏后的超声信号随着超声强度变化情况,SEM检测其爆破后的形貌变化。(3)利用双氧水建立凋亡模型,激光共聚焦观察靶向载AAIB脂质PLGA杂合泡和非靶向载AIB脂质PLGA杂合泡超声爆破释放探针检测凋亡的情况。(4)伊文思蓝渗出量观察不同超声参数联合载AAIB脂质PLGA杂合泡开放血脑屏障程度,同时HE和TUNEL染色检测其出血和凋亡情况,并在IVIS小动物成像仪器上测量其荧光成像效果和在体内主要器官分布情况。根据筛选的超声参数,运用IVIS小动物成像仪器观察靶向载AAIB脂质PLGA杂合泡和非靶向载AIB脂质PLGA杂合泡开放血脑屏障后荧光成像随时间变化趋势,并用数学模型分析靶向组和非靶向组变化速率。通过细胞活性实验筛选超声联合载AAIB和AIB脂质PLGA杂合泡诱发凋亡的超声参数和抗凋亡药物,并同荧光探针包裹在脂质PLGA杂合泡中,通过SEM和马尔文粒径仪检测其形貌和粒径,液相色谱仪检测其药物负载率。激光共聚焦检测载药组与未载药组的凋亡情况,活性氧和线粒体超氧化物染色检测药物抑制凋亡的一般机制。(5)运用IVIS小动物成像仪器观察载药和AAIB脂质PLGA杂合泡和未载药只载AAIB脂质PLGA杂合泡开放血脑屏障后荧光成像随时间变化趋势,TUNEL染色检测凋亡情况,DHE染色检测体内活性氧水平。HE染色和血常规检测载AAIB脂质PLGA杂合泡和载AIB脂质PLGA杂合泡的毒副作用。[结 果](1)马尔文粒径仪检测显示非靶向Avidin-ICG-BSA荧光探针平均粒径为31.2nm,在连接Annexin V上后平均粒径为20.3nm;透射电镜检测显示,探针形态规则,粒径较均一呈球形,分散度较好,无黏附聚集现象;荧光分度计结果显示,荧光探针中ICG发射波长在795～845nm间,未发生偏移。(2)TEM和SEM下观察载Annexin V-Avidin-ICG-BSAPLGA杂合泡形貌呈球形,内部为空腔,分散较好;马尔文激光粒径仪检测结果微泡在包裹Annexin V-Avidin-ICG-BSA 和 Avidin-ICG-BSA 粒径为 844.3±114.5nm,未发生明显变化;利用DiO亲脂性染微泡表面,在激光共聚焦显微镜下观察发现,探针均匀地分散微泡内部,荧光共定位发现DiO绿色荧光覆盖住探针的红色荧光;SDS-PAGE凝胶电泳发现,靶向微泡中含有Annexin V靶向蛋白,而非靶向微泡只有Avidin和BSA,并且随着探针投入量增加,微泡载探针量也在增加,当投入量达到100ug时达到饱和;IVIS小动物成像仪器检测显示,载Annexin V-Avidin-ICG-BSA和Avidin-ICG-BSA脂质PLGA杂合泡具有良好荧光成像效果,并且随着浓度增加而荧光信号变强。(3)激光共聚焦显微镜下观察发现,具有靶向AnnexinV的荧光探针和碘化丙啶同时把坏死细胞和凋亡晚期的细胞染色,而非靶向荧光探针组仅被碘化丙啶染色;载靶向荧光探针PLGA杂合泡,同时用1.OMpa的超声能量爆破后孵育20min,激光共聚焦显微镜下观察发现,超声爆破组凋亡细胞荧光强度较强,而未超声的则荧光强度较弱。(4)随着超声能量增加脑实质内EB渗出量增加,同时HE染色发现超声能量为0.6和0.8Mpa时未见明显出血,而超声能量为1Mpa时则见明显出血。TUNEL凋亡检测发现,随着超声能量增大绿色荧光凋亡小体明显增多。数学模型发现前3h靶向组MAAIB和非靶向组MAIB的荧光探针净入率分别为0.76和0.7,无明显差异,但在3h后靶向组MAAIB和非靶向组MAIB的荧光探针净出率分别为0.32和0.56。(5)随着超声能量和辐照时间增加细胞活性降低,药物治疗初步表明GAS、GSH和DMSO都可以提高细胞的活性,但是发现DMSO高浓度则对细胞有毒性作用。载药和荧光探针PLGA杂合泡的形貌、粒径、分散性与未载药的荧光探针PLGA杂合泡未有明显差异。超声爆破后37℃孵育4h,激光共聚焦显微镜观察发现药物治疗组MGAAIB组绿色荧光明显减少流式分析结果表明凋亡率从27.8%降到17.3%。IVIS成像结果表明,MGAAIB组脑部荧光强度前3h上升与MAAIB组一致,而后MGAAIB组12h脑部荧光强度降低趋势快于MAAIB组,并且在12h、16h具有显著差异,。TUNEL染色结果表明,凋亡总体荧光强度与IVIS成像结果一致,说明药物可以逆转凋亡从而减少AAIB在脑部的停留。DHE染色检测体内活性氧水平,发现MGAAIB组较MAAIB组活性氧水平下降,同时发现AAIB和TUNEL的荧光强度也同时减弱。[结 论]本研究成功制备了靶向凋亡的荧光探针和载荧光探针脂质PLGA杂合泡,荧光探针能够较好地检测凋亡,并且载荧光探针脂质PLGA杂合泡在超声爆破后可以释放出来检测体内外其诱发的凋亡,并且把抗凋亡药物GAS包裹其中,使其具备了在检测凋亡的同时具有抑制凋亡作用,实现了超声血脑屏障开放和凋亡检测与治疗一体化,这为聚焦超声联合微泡开放血脑屏障诊疗一体化提供了新视角,并且促进该技术向临床转化。