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目的:艾滋病即获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)引起的一种免疫缺陷性疾病，该病毒主要侵犯CD4+T细胞，HIV侵入CD4+T细胞后，一方面可整合到细胞染色体上，随细胞分裂而传至子代，长期潜伏；另一方面可大量繁殖，造成感染细胞的死亡，导致免疫活性细胞，尤其是辅助性T细胞(Th)的减少；同时伴有多种细胞因子产生障碍，导致免疫缺陷而合并多种机会性感染及继发性肿瘤，最后病人因丧失免疫功能而死亡。
T细胞可以介导迟发型超敏性反应、抗胞内病原体感染、抗肿瘤免疫、同种移植排斥反应等细胞免疫效应。由T细胞介导的细胞免疫主要由二种不同的T细胞亚群参与，一种是CD4+的辅助性T细胞(Th)，该细胞和抗原起反应后可分泌IFN-γ等细胞因子；另一种是CD8+的细胞毒性T细胞(cytotoxicTlymphocytes，CTL)，对靶细胞有特异杀伤作用并分泌IFN-γ等细胞因子。研究发现CTL应答是在HIV感染急性期能测出的最早的HIV特异性免疫应答反应，HIV-1特异性CTL在抗HIV-1感染的免疫应答中起重要作用。HIV感染后病情进展缓慢或长期不进展者HIV特异性CTL功能强，抗逆转录病毒治疗有效者CTL功能明显增高。大量体内体外实验表明Th应答在活化CTL中起重要作用，有必要对CTL和Th功能同时进行研究。评价HIV特异性IFN-γ分泌性T细胞功能对疫苗开发和免疫治疗具有重要意义。
国外研究特异性IFN-γ分泌性T细胞或CTL功能时，使用的表位多为欧美流行毒株HIV-1B、HIV-1C及HIV-1A/E亚型，研究对象多为非洲和欧美人群，国内研究使用的表位为HIV-1B亚型，且集中在对CTL应答的研究上。由于我国人群的人种特性与非洲及白种人不同，且我国的主要流行毒株为HIV-B’亚型，目前有关中国患者针对HIV-1B’亚型的特异性T细胞应答与疾病进展相关性的研究尚未见报道，因此，研究我国HIV/AIDS患者特异性IFN-γ分泌性T细胞功能及其与疾病进展的关系具有重要意义。
本研究用覆盖中国主要流行毒株HIV-1B’亚型结构蛋白Gag全长的54个重叠多肽作为抗原，评价58名中国HIV/AIDS患者的IFN-γ分泌性T细胞功能。
方法1.研究对象：由中国医科大学艾滋病研究所艾滋病确认实验室经Genelab公司蛋白印迹试剂盒确认为阳性的HIV/AIDS患者58例。所有标本均在未接受抗病毒治疗情况下采集。疾病分期根据《中华人民共和国HIV/AIDS诊断标准》，疾病长期不进展者(longtermnonprogressor，LTNP)：CD4+T淋巴细胞≥500×106/L，感染HIV10年以上，未经抗病毒治疗，无艾滋病指征性疾病；无症状HIV感染期：除LTNP以外，CD4+T淋巴细胞≥200×106/L，无艾滋病指征性疾病；AIDS期：CD4+T淋巴细胞＜200×106/L或有艾滋病指征性疾病。58例HIV/AIDS患者包括15例疾病长期不进展者，33例无症状HIV感染者，10例AIDS患者。6名健康志愿者作为对照。
2.标本收集：收集患者EDTA抗凝全血20ml，Ficoll-paque密度梯度离心法提取外周血单个核细胞(PBMC)。
3.HIV-1多肽：覆盖HIV-1B’亚型Gagp17、p24和p2p7p1p6全长的54个重叠多肽由自动多肽合成机(MBS396，AdvancedChemTech，Louisville，KY)合成(西安美联公司)，其中每个多肽长15-22个氨基酸，相邻多肽间重叠10个氨基酸。
4.IFN-γELISPOT法测定T细胞应答：采用美国BD公司IFN-γELISPOT试剂盒测定。用IFN-γ捕获抗体包被PVDF膜96孔板，每孔加入100μl浓度为2-3×106/ml的患者PB-MC，同时加入上述HIV-1多肽；阳性对照孔加入PHA作为质控，阴性对照孔加入完全培养基，37℃，5％CO2孵育20-24小时。加入生物素标记的检测抗体，室温孵育2小时后加入辣根过氧化酶标记的链菌亲和素，1小时后加入显色剂，30min后终止反应。经美国CTL公司ELISPOT分析仪读取孔中斑点个数，减去阴性对照孔的平均值后根据孔中细胞浓度计算每106个PBMC中点形成细胞个数(spotformingcells，SFC)结果为点形成单位(spotformingunit，SFU)。SFU高于阴性对照平均值2个标准差以上为阳性。对反应宽度(引起每个患者发生特异性应答的肽段个数)和反应强度(每个患者各个阳性孔中斑点计数之和)2项指标进行比较分析。
5.CD4+T细胞绝对计数：将20μlCD4/CD8/CD3三色单抗(BECTONDICKINSON)加入绝对计数管中，加入50μl抗凝全血，室温避光15min，加入免洗溶血素450μl，室温避光15min，FACSCalibor(BECTONDICKINSON)检测，MULTISET软件进行自动分析，计算CD4+、CD8+、CD3+淋巴细胞绝对值及相应比值等。
6.病毒载量测定：以200μl血浆采用标准版模板制备法提取RNA，用美国Roche公司的COBASAMPLICOR自动载量仪RT-PCR方法测定病毒载量。检测范围为400-750，000copies/ml。
7.统计学分析：用SPSS11.5统计软件包进行统计学分析。用单因素方差分析(onewayANOVA)进行多组间的均值比较。用Pearson相关系数来比较反应强度及反应宽度与CD4+T淋巴细胞绝对计数及HIV-1RNA病毒载量的相关性。
结果1.中国HIV/AIDS患者特异性T细胞对不同HIV-1B’Gag表位的应答情况：
58名患者中，75.0％识别p17；86.7％识别p24；75.0％识别p2p7p1p6；各患者对于多肽表位的识别情况不同，其中对p24-19和p17-5的识别百分率最高，分别为43.10％和41.38％。
2.中国不同疾病进程HIV/AIDS患者识别HIV-1B’Gag表位的反应宽度和反应强度比较：
将患者按照疾病进展程度分为3组：长期不进展者、无症状HIV感染者和AIDS患者。单因素方差分析显示：3组患者识别HIV-1多肽发生特异性T细胞应答的反应宽度为长期不进展者＞无症状HIV感染者＞AIDS患者，其中长期不进展者反应宽度显著高于其他2组患者(p=0.001，p=0.005)，3组患者识别HIV-1多肽的反应强度亦为长期不进展者＞无症状HIV感染者＞AIDS患者，但未发现显著性差异(p＞0.05)。
3.中国HIV/AIDS患者识别HIV-1B’Gag表位的反应宽度、反应强度和病毒载量、CD4+T淋巴细胞绝对计数相关性：
患者识别HIV-1B’多肽发生特异性T细胞应答的反应宽度与病毒载量呈显著负相关(r=-0.374，p=0.004)，与患者CD4+T淋巴细胞绝对计数呈显著正相关(r=0.425，p=0.001)。患者识别HIV-1多肽的反应强度与病毒载量呈显著负相关(r=-0.285，p=0.030)，与患者CD4+T淋巴细胞绝对计数呈正相关趋势(r=0.159，p＞0.05)，但无显著性差异。
4.中国健康人群对HIV-1B’Gag表位的应答情况
6例健康对照中未发现对HIV-1多肽的特异性反应。
结论1.中国HIV/AIDS患者HIV-1B’特异性IFN-γ分泌性T细胞功能与病毒载量显著负相关，提示HIV-1B’特异性IFN-γ分泌性T细胞在控制HIV病毒血症中起重要作用。
2.HIV感染的疾病长期不进展者HIV-1B’特异性IFN-γ分泌性T细胞功能显著高于无症状HIV感染者和AIDS患者，提示HIV/AIDS患者病程随HIV特异性IFN-γ分泌性T细胞功能下降而进展。