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小麦白粉病是由小麦白粉病菌(Blurmeria graminis f.sp.tritici,Bgt)引发的真菌性病害,是世界上许多国家小麦生产中危害日趋严重的病害之一。抗白粉病基因Pm21来自小麦近源物种簇毛麦(Haynaldia villosa L.,2n=2x=14,基因组VV),Pm21对目前国内所有小麦白粉菌生理小种表现免疫,具有抗性强、抗谱广的特点,本实验室创制的含Pm21的小麦-簇毛麦异易位系已经在我国小麦育种中广泛应用。然而,Pm21基因介导的广谱抗白粉病的分子机制仍不清楚。因此,在簇毛麦中克隆更多的抗白粉病相关基因,对于解析广谱抗白粉病的抗性机制和信号通路有重要意义,也可为小麦抗白粉病分子改良提供新的基因资源和技术思路。本实验室在前期研究中,利用大麦基因芯片杂交技术,在簇毛麦中克隆了一个编码E3泛素连接酶的基因CMPG1-V,并通过转基因试验证明该基因在小麦抗白粉中发挥重要作用。为进一步明确该基因的功能及作用机制,本研究通过同源克隆、目的基因表达模式分析、点突变实验及RNAi技术进一步分析CMPG1-V在小麦抗白粉病中的功能及作用机制,获得的主要研究结果如下:1.通过同源克隆从14份普通小麦及小麦近缘物种中克隆获得38个CMPG同源基因,分别来自A、B、D、H、V及R基因组。氨基酸序列比对结果表明:CMPG序列在麦类作物中非常保守,与CMPG1-V的相似性达91.41%-98.46%。2.通过CMPG1-V与TaCMPGs的核苷酸序列比对,开发扩增CMPG1-V的特异引物CMPG-NP-F/CMPG-NP-R,利用一套普通小麦-簇毛麦异染色体系进行染色体定位分析,将CMPG1-V定位在簇毛麦染色体6V长臂上。通过BLASTn分析发现,CMPG1-V同源基因分别位于大麦6HL、短柄草3号染色体长臂(Bd3L)及水稻2号染色体(R2)上,Bd3L及R2与小麦第六群染色体长臂有共线性关系;来自小麦的TaCMPGs 分别定位于 6AL4-0.55-0.90,6BL5-0.40-1.00 和 6DL12-0.68-0.74 上。3.利用YFP-CMPG1-V及编码细胞器标志蛋白的基因转化扬麦158原生质体,进行亚细胞定位分析。结果表明,YFP-CMPG1-V主要定位于细胞膜、内质网及细胞核,在 TGN/EE(Trans-Golgi Network/Early Endosome)中也有部分定位。4.利用23个白粉菌生理小种对前期获得的两个T2代CMPG1-V转基因小麦株系T2-26及T2-46进行苗期白粉病抗性鉴定,发现两个株系对18个生理小种表现为高抗。其衍生的T4代转基因植株受白粉菌诱导后,SA通路中的PR基因(PR1、PR2及PR10)及Chitinase1、Chitinase2的表达显著高于受体品种扬麦158;H2O2含量、POD及APX酶活均显著高于扬麦158;在接种白粉菌24 h及48 h后,发生细胞程序性死亡(Program Cell Death,PCD)的表皮细胞比例(13.66%～33.77%)显著高于扬麦158(3.33%～3.82%)。推测在白粉菌侵染早期,在过量表达CMPG1-V的转基因植株表皮细胞中,在侵染点发生的ROS积累及PCD抑制了白粉菌的生长及扩展,从而提高了植株对白粉病的抗性。5.利用基因枪介导的遗传转化在抗白粉病小麦品种南农9918(携带抗白粉病基因Pm21)中沉默CMPG基因,获得396棵再生植株,其中9株通过PCR检测为转基因阳性。qRT-PCR分析表明其中5株中CMPG表达量成功降低,抗白粉病离体鉴定及菌丝发育显微观察结果表明:CMPG表达量低的转基因阳性植株白粉菌次级菌丝生长(SH,17.54%～20.79)及分生孢子梗发育(CH,1.96%～4.48%)显著高于受体品种南农 9918(SH:9.52%及 CH:0.67%),SA 通路 PR基因(PR1、PR2及 PR10)的表达量则低于南农9918。扬麦158中CMPG1-V过量表达及南农9918中RNAi沉默CMPG转基因试验结果表明:CMPG1-V及南农9918中CMPG基因在小麦抗白粉病中均发挥正向调控的作用,SA信号通路及H2O2通路与其介导的白粉病抗性紧密相关。6.为研究CMPG1-V的U-Box区域对于其泛素连接酶活性的影响,将CMPG1-V U-Box区域53位半胱氨酸(C53)及80位色氨酸(W80)突变为丙氨酸(A),获得突变型CMPG1-VC53A、CMPG1-VW80A及CMPG1-VC53A W80A基因,In vivo及in vitro 泛素化实验显示:CMPG1-VC53A、CMPG1-VW80A及 CMPG1-VC53AW80A均不再具有泛素连接酶活性,证明C53及W80是保证CMPG1-V泛素连接酶活性的关键位点。GFP-CMPG1-VC53AW80A与YFP-CMPG1-V共定位实验表明:CMPG1-V泛素连接酶活性的缺失并不影响其亚细胞定位。7.利用基因枪法将突变基因CMPG1-VC53AW80A_HA转化扬麦158,获得141棵To代再生植株,其中1个T1代阳性株系CMPG1-VC53AW80A-HA蛋白积累正常,苗期白粉病离体鉴定结果表明,其对白粉病的抗性和受体扬麦158相比无差异。证明CMPG1-V E3泛素连接酶活性与其在抗白粉病中的功能直接相关。8.以CMPG1-V 1-118aa片段为抗原,制备CMPG1-V单克隆抗体,获得11管腹水,初步验证结果表明,编号分别为199461R1-1/3N3及199461R1-1/4D18特异性及效价最高,制备为单克隆抗体,用于研究CMPG蛋白积累、修饰及其互作蛋白。9.利用CMPG1-V单克隆抗体anti-CMPG 4D18检测扬麦158及簇毛麦叶片中CMPG蛋白,结果发现,在未处理的样品中,难以检测到CMPG蛋白;利用Ub/26S蛋白酶体抑制剂AM114处理扬麦158原生质体,发现处理后CMPG蛋白积累显著增加;簇毛麦叶片受小麦白粉菌E26诱导后,其中CMPG1-V蛋白积累量也快速并显著增加。结合CMPG E3泛素连接酶活性分析,推测CMPG具有E3泛素连接酶活性并能够发生自泛素化,在细胞中可被Ub/26S蛋白酶体降解调控,维持较低的蛋白丰度;当植株受到病原菌侵染时,CMPG积累量增多,表明CMPG蛋白积累量的变化与其抗白粉病功能密切相关。