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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一种由肝细胞引发的原发性恶性肿瘤,它被认为是世界上第三大与癌症相关的死亡疾病。尽管针对于HCC的诊断技术和治疗策略取得了进展,比如肝移植、放疗、化疗或药物联合治疗,但是预后效果都不甚理想。HCC的发生发展是一个多步骤多阶段的复杂过程,其中包括抑癌相关基因的抑制和癌基因的激活,在这些被改变的基因中,人类抑癌基因p53功能的改变无疑是重要的。随着对p53信号通路的深入研究,基于p53的肿瘤治疗越来越被人们所重视。近年有研究表明,干扰素刺激基因15(ISG15)可以与p53蛋白结合,对其进行ISG化修饰后被20S蛋白酶降解。在此过程中,ISG15 E3连接酶HERC5起到了至关重要的识别作用。然而,HERC5在HCC中的表达和作用鲜有相关报道。本实验主要观察ISG15和HERC5在HCC组织和细胞中的表达变化,设计合成了能够与其特异性结合形成稳定结构的7,11-位双取代的喹啉衍生物HZ-6d,最后在体内外对HZ-6d的抗癌活性及其相关机制进一步验证和探讨。主要的研究内容概括如下:(1)HERC5和ISG15在HCC中的表达人HCC组织采集自安徽医科大学附属医院,体外我们培养人正常肝组织L-02以及人肝癌细胞系Hep G2和SMMC-7721。通过免疫组化,Western blot和qPCR技术检测HERC5和ISG15的表达变化。实验结果发现,在人HCC组织和细胞中HERC5和ISG15的表达均有明显升高。(2)HERC5对HepG2和SMMC-7721增殖、凋亡以及p53蛋白的影响在HepG2和SMMC-7721细胞中,通过转染HERC5小干扰RNA(HERC5siRNA)和过表达质粒建立沉默和过表达HERC5细胞模型,MTT和平板克隆检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡变化,采用Western blot技术检测的p53,p21和Bax/Bcl-2的蛋白表达。实验结果显示:沉默HERC5能抑制HepG2和SMMC-7721细胞的增殖和集落形成,促进细胞的凋亡,同时增加p53,p21和Bax/Bcl-2的蛋白表达;过表达HERC5能促进HepG2和SMMC-7721细胞的增殖和集落形成,同时减少p53,p21和Bax/Bcl-2的蛋白表达。(3)HZ-6d与HERC5的结合研究应用计算机模拟对接技术和圆二色光谱法(CD assay)检测化合物HZ-6d与HERC5的富G序列形成的G-四链体的稳定性。测试结果显示:CD光谱和计算机模拟对接结果显示化合物HZ-6d对HERC5 G-四链体显示出良好的结合作用。(4)HZ-6d的体内外抗癌活性研究通过在裸鼠皮下注射SMMC-7721细胞建立HCC移植瘤模型,对HZ-6d的抗肿瘤效果进行评估。免疫组化和Western blot检测HERC5,ISG15的蛋白表达。实验结果表明:HZ-6d能够有效的抑制移植瘤的生长,并减少HERC5和ISG15的表达;在HepG2和SMMC-7721细胞中,加入不同浓度的HZ-6d刺激24h。采用MTT和平板克隆检测细胞增殖情况,划痕实验检测细胞迁移情况,流式细胞术检测细胞凋亡变化。同时,Western blot和qPCR技术检测HERC5,ISG15,p53通路表达变化。实验结果显示:HZ-6d能够有效抑制肝癌细胞的生长,减少HERC5和ISG15的表达并增加p53蛋白的表达。(5)进一步探讨HZ-6d抗肿瘤机制在HepG2和SMMC-7721中,通过HERC5 siRNA建立沉默HERC5细胞模型,加入HZ-6d刺激24h。Western blot技术检测p53通路蛋白表达变化。实验结果显示:HERC5 siRNA和HZ-6d单处理组均能激活p53通路蛋白表达,而HERC5siRNA和HZ-6d共处理组则能更大程度的激活p53通路。上述结果提示,ISG15和HERC5在HCC中高表达,并促进HCC的发展。HZ-6d可能通过靶向HERC5形成稳定的G-四链体结构,降低HERC5的表达,从而抑制了p53蛋白依赖于ISG15途径的降解,进一步激活p53信号通路,发挥其肿瘤活性。