真菌细胞壁是包被于细胞膜外的一种刚性结构,与真菌的各种生理活动相关。细胞壁的骨架由多糖组成,以含有β-1,6分支的β-1,3葡聚糖为主链,其上共价连接着几丁质、半乳甘露聚糖等其它多糖。灰盖鬼伞是一种研究真菌生长发育过程的模式真菌,生长周期短,子实体的生长从菌柄的伸长生长开始到伞盖完全自溶释放担孢子结束,在上述过程中细胞壁葡聚糖经历了 一系列动态的变化,包括延长、分支、水解和交联等,多种葡聚糖酶参与了上述重构过程。为了探究有哪些葡聚糖酶参与了细胞壁的重构,本实验室前期分别从灰盖鬼伞的菌柄和伞盖中各提取到了一个具有葡聚糖水解酶活性的蛋白,菌柄中的大小为302.2 kDa,由三个大小分别为165.2、87.9和56.8 kDa的亚基组成;伞盖中的大小为109 kDa,由两个大小分别为60和53 kDa的亚基组成,经质谱鉴定,这两个蛋白为同一个蛋白:胞外β-葡萄糖苷酶(BGL2)。同一个基因,在菌柄和伞盖中编码产生了不同的变体,为了进一步研究BGL2的生理功能,我们对BGL2的不同变体进行体外重组表达。我们采用真核表达系统,以毕赤酵母为宿主细胞,成功表达出了全长的β-葡萄糖苷酶(BGL2)。利用Ni-柱亲和层析的方法对其进行纯化,纯化后的酶对pNpG的水解活性达到了 4.18U/mg,蛋白得率为21.83%。SDS-PAGE显示,BGL2分子量为152.3 kDa,远高于理论分子量96.6 kDa,表明该蛋白存在着糖基化修饰。采用高效离子色谱-二级质谱连用技术分析发现,BGL2不仅能降解昆布寡糖,还能在昆布寡糖的非还原端添加一个以1,6糖苷键连接的的葡萄糖残基,形成一个含有1,6分支的葡聚糖,而且寡糖糖链越长,BGL2的转糖苷活性越高。酶浓度对BGL2的转糖苷活性有一定的影响,低浓度的酶(0.63X10-4 U、0.13x10-3 U)对昆布寡糖主要起水解作用,酶浓度较高(0.63X10-3U)时才有转糖苷产物出现,待浓度进一步提高(1.26x10-3 U、2.52x10-3U)时,水解产物和转糖苷产物会持续增加,直至最终被完全水解为葡萄糖。葡萄糖对BGL2的转糖苷活性也有一定的影响,反应体系中加入葡萄糖后,葡萄糖能够抑制昆布寡糖原有水解产物的水解,同时也能够抑制转糖苷产物的进一步水解。分别利用毕赤酵母和大肠杆菌作为宿主细胞,对BGL2不同截短片段进行重组表达,都没有得到有活性的目的片段。因此我们用蛋白酶对重组表达的BGL2全长进行水解,发现经胰蛋白酶作用后,BGL2的水解活性增加了将近两倍。SDS-PAGE显示,BGL2被胰蛋白酶水解为两个大小分别为84.9 kDa和58.1 kDa的小蛋白,这与我们之前从菌柄中获得的两个小亚基大小接近。采用pNGase酶法对其去糖基化后进行 N端测序,58.1kDa的小条带N端序列为Thr-Gln-Thr-Leu-Val-Ala-Lys-Glu-Ala,此位点可能是 BGL2 的一个剪切位点,对于后续的研究具有重要的作用。本论文研究发现灰盖鬼伞中的BGL2具有分支酶活性,可能参与细胞壁重构过程中β-1,3葡聚糖分支的形成,同时BGL2经胰蛋白酶作用后,蛋白被水解为两个较小的亚基,水解活性增加,初步推测灰盖鬼伞可能通过翻译后剪切调节BGL2的活性。